Os cientistas estão descobrindo o ciclo de vida do SARS-CoV-2 e como o vírus usa truques para escapar da detecção.
O coronavírus ostenta um luxuoso casaco de açúcar. “É impressionante”, pensou Rommie Amaro, olhando para sua simulação de computador de uma das proteínas de pico de marca registrada do SARS-CoV-2, que se projetam da superfície do vírus. Estava envolto em moléculas de açúcar, conhecidas como glicanos.
“Quando você vê isso com todos os glicanos, é quase irreconhecível”, diz Amaro, um químico biofísico computacional da Universidade da Califórnia, San Diego.
Muitos vírus têm glicanos cobrindo suas proteínas externas, camuflando-os do sistema imunológico humano como um lobo em pele de cordeiro. Mas no ano passado, o grupo de laboratório de Amaro e colaboradores criaram a visualização mais detalhada já feita deste casaco, com base em dados estruturais e genéticos e processados átomo por átomo por um supercomputador. Em 22 de março de 2020, ela postou a simulação no Twitter. Em uma hora, um pesquisador perguntou em um comentário: o que era a alça nua e sem revestimento saindo do topo da proteína?
Amaro não fazia ideia. Mas dez minutos depois, o biólogo estrutural Jason McLellan da Universidade do Texas em Austin interrompeu: o loop não revestido era um domínio de ligação ao receptor (RBD), uma das três seções do pico que se ligam aos receptores nas células humanas (consulte ‘A Espigão’).
Na simulação de Amaro, quando o RBD se ergueu acima da nuvem de glicano, dois glicanos avançaram para travá-lo no lugar, como um suporte em uma bicicleta. Quando Amaro alterou os glicanos no modelo de computador, o RBD entrou em colapso. A equipe de McLellan construiu uma maneira de tentar o mesmo experimento no laboratório e, em junho de 2020, os colaboradores relataram que a mutação dos dois glicanos reduziu a capacidade da proteína spike de se ligar a um receptor de célula humana1 – uma função que ninguém tinha anteriormente reconhecido em coronavírus, diz McLellan. É possível que cortar esses dois açúcares reduza a infectividade do vírus, diz Amaro, embora os pesquisadores ainda não tenham uma maneira de fazer isso.
Desde o início da pandemia COVID-19, os cientistas têm desenvolvido uma compreensão detalhada de como o SARS-CoV-2 infecta as células. Ao desmontar o processo de infecção, eles esperam encontrar melhores maneiras de interrompê-lo por meio de melhores tratamentos e vacinas, e aprender por que as cepas mais recentes, como a variante Delta, são mais transmissíveis.
O que emergiu de 19 meses de trabalho, apoiado por décadas de pesquisa de coronavírus, é um relato passo a passo de como o SARS-CoV-2 invade células humanas (consulte “Ciclo de vida do coronavírus pandêmico”). Os cientistas descobriram adaptações importantes que ajudam o vírus a se agarrar às células humanas com uma força surpreendente e, em seguida, se esconder uma vez dentro. Mais tarde, ao deixar as células, o SARS-CoV-2 executa uma etapa de processamento crucial para preparar suas partículas para infectar ainda mais células humanas. Estas são algumas das ferramentas que permitiram ao vírus se espalhar tão rapidamente e ceifar milhões de vidas. “É por isso que é tão difícil de controlar”, diz Wendy Barclay, virologista do Imperial College London.
Farpado e pronto
Tudo começa com os picos. Cada vírion SARS-CoV-2 (partícula de vírus) tem uma superfície externa salpicada com 24/40 proteínas espigadas dispostas ao acaso que são a chave para a fusão com as células humanas. Para outros tipos de vírus, como influenza, as proteínas de fusão externas são relativamente rígidas. Os picos do SARS-CoV-2, no entanto, são descontroladamente flexíveis e articulam-se em três pontos, de acordo com o trabalho publicado em agosto de 2020 pelo bioquímico Martin Beck no Instituto Max Planck de Biofísica em Frankfurt, Alemanha, e seus colegas.
Isso permite que as pontas girem, balancem e girem, o que pode facilitar a varredura da superfície da célula e a ligação de várias pontas a uma célula humana. Não há dados experimentais semelhantes para outros coronavírus, mas como as sequências de proteínas do pico são altamente conservadas evolutivamente, é justo presumir que a característica é compartilhada, diz Beck.
No início da pandemia, os pesquisadores confirmaram que os RBDs das proteínas de pico do SARS-CoV-2 se ligam a uma proteína conhecida chamada de receptor ACE2, que adorna a parte externa da garganta e das células pulmonares humanas. Esse receptor também é o ponto de ancoragem do SARS-CoV, o vírus que causa a síndrome respiratória aguda grave (SARS). Mas, em comparação com o SARS-CoV, o SARS-CoV-2 liga-se ao ACE2 cerca de 2 a 4 vezes mais fortemente4, porque várias alterações no RBD estabilizam seus pontos de acesso de ligação ao vírus.
Variantes preocupantes de SARS-CoV-2 tendem a ter mutações na subunidade S1 da proteína spike, que hospeda os RBDs e é responsável pela ligação ao receptor ACE2. (Uma segunda subunidade de pico, S2, solicita a fusão viral com a membrana da célula hospedeira.)
A variante alfa, por exemplo, inclui dez mudanças na sequência da proteína spike, o que resulta em RBDs sendo mais propensos a permanecer na posição “para cima”. “Ele está ajudando o vírus ao torná-lo mais fácil de entrar nas células”, diz Priyamvada Acharya, biólogo estrutural do Duke Human Vaccine Institute em Durham, Carolina do Norte, que está estudando as mutações de pico.
A variante Delta, que agora está se espalhando pelo mundo, hospeda várias mutações na subunidade S1, incluindo três no RBD que parecem melhorar a capacidade do RBD de se ligar ao ACE2 e escapar do sistema imunológico.
Entrada restrita
Uma vez que os picos virais se ligam a ACE2, outras proteínas na superfície da célula hospedeira iniciam um processo que leva à fusão das membranas virais e celulares (ver ‘Entrada viral de perto’).
O vírus que causa a SARS, o SARS-CoV, usa uma das duas enzimas protease do hospedeiro para invadir: TMPRSS2 (pronuncia-se ‘tempress dois’) ou catepsina L. TMPRSS2 é a rota mais rápida, mas o SARS-CoV costuma entrar em vez de um endossomo – uma bolha cercada por lipídios – que depende da catepsina L. Quando os vírions entram nas células por essa via, no entanto, as proteínas antivirais podem prendê-los.
O SARS-CoV-2 difere do SARS-CoV porque usa com eficiência a TMPRSS2, uma enzima encontrada em grandes quantidades na parte externa das células respiratórias. Primeiro, o TMPRSS2 corta um site na subunidade S2 8 do pico. Esse corte expõe uma série de aminoácidos hidrofóbicos que rapidamente se enterra na membrana mais próxima – a da célula hospedeira. Em seguida, o pico estendido dobra-se sobre si mesmo, como um zíper, forçando a fusão das membranas viral e celular.
O vírus então ejeta seu genoma diretamente na célula. Ao invadir dessa forma carregada de mola, o SARS-CoV-2 infecta mais rápido do que o SARS-CoV e evita ficar preso em endossomos, de acordo com um trabalho publicado em abril por Barclay e seus colegas no Imperial College London.
A entrada rápida do vírus usando TMPRSS2 explica por que o medicamento contra a malária cloroquina não funcionou em testes clínicos como um tratamento COVID-19, apesar dos primeiros estudos promissores em laboratório. Essas células usaram células que dependem exclusivamente de catepsinas para a entrada endossômica. “Quando o vírus se transmite e se replica nas vias respiratórias humanas, ele não usa endossomos, então a cloroquina, que é uma droga desreguladora do endossoma, não é eficaz na vida real”, diz Barclay.
A descoberta também aponta para os inibidores de protease como uma opção terapêutica promissora para evitar que um vírus use TMPRSS2, catepsina L ou outras proteases para entrar nas células hospedeiras. Um inibidor de TMPRSS2, mesilato de camostat, que é aprovado no Japão para tratar pancreatite, bloqueou a entrada viral nas células pulmonares, mas a droga não melhorou os resultados dos pacientes em um ensaio clínico inicial.
“Do meu ponto de vista, devemos ter inibidores de protease como antivirais amplos disponíveis para combater novos surtos de doenças e prevenir futuras pandemias logo no início”, disse Stefan Pöhlmann, diretor da Unidade de Biologia de Infecção do Centro Alemão de Primatas em Göttingen, que tem liderou pesquisas sobre a ligação ACE2 e a via TMPRSS2.
Competição mortal
As próximas etapas da infecção são mais obscuras. “Há muito mais caixas pretas quando você está dentro da célula”, diz a química Janet Iwasa, da Universidade de Utah em Salt Lake City, que está desenvolvendo uma animação anotada do ciclo de vida viral. “Há mais incertezas e hipóteses concorrentes.”
Depois que o vírus dispara seu genoma de RNA na célula, os ribossomos no citoplasma traduzem duas seções do RNA viral em longas cadeias de aminoácidos, que são então cortados em 16 proteínas, incluindo muitas envolvidas na síntese de RNA. Posteriormente, são gerados mais RNAs que codificam um total de 26 proteínas virais conhecidas, incluindo aquelas estruturais usadas para fazer novas partículas virais, como o pico e outras proteínas acessórias. Dessa forma, o vírus começa a produzir cópias de seu próprio RNA mensageiro. Mas ele precisa da maquinaria da célula para traduzir esses mRNAs em proteínas.
Os coronavírus assumem esse mecanismo de várias maneiras. A virologista Noam Stern-Ginossar e sua equipe do Instituto de Ciência Weizmann em Rehovot, Israel, analisaram três mecanismos pelos quais o SARS-CoV-2 suprime a tradução do mRNA do hospedeiro em favor do seu próprio. Nenhum é exclusivo deste vírus, mas a combinação, velocidade e magnitude dos efeitos parecem únicos, diz Stern-Ginossar.
Primeiro, o vírus elimina a competição: a proteína viral Nsp1, uma das primeiras proteínas traduzidas quando o vírus chega, recruta proteínas do hospedeiro para fragmentar sistematicamente todos os mRNAs celulares que não têm uma etiqueta viral. Quando a equipe de Stern-Ginossar colocou a mesma etiqueta no final de um mRNA hospedeiro, o mRNA não foi picado.
Em segundo lugar, a infecção reduz a tradução geral da proteína na célula em 70%. Nsp1 é novamente o principal culpado, desta vez bloqueando fisicamente o canal de entrada dos ribossomos para que o mRNA não possa entrar, de acordo com o trabalho de duas equipes de pesquisa. A pouca capacidade de tradução que resta é dedicada aos RNAs virais, diz Stern-Ginossar.
Finalmente, o vírus desliga o sistema de alarme da célula. Isso acontece de várias maneiras, mas a equipe de Stern-Ginossar identificou um mecanismo claro para o SARS-CoV-2: o vírus impede que o mRNA celular saia do núcleo, incluindo instruções para proteínas destinadas a alertar o sistema imunológico sobre a infecção. Uma segunda equipe confirmou esse achado e novamente apontou para Nsp1: a proteína parece obstruir os canais de saída no núcleo para que nada possa escapar.
Como os transcritos de genes não podem sair do núcleo, as células infectadas não liberam muitos interferons – são proteínas de sinalização que alertam o sistema imunológico sobre a presença de um vírus. O SARS-Cov-2 é particularmente eficiente para desligar este sistema de alarme: em comparação com outros vírus respiratórios, incluindo o SARS-CoV e o vírus sincicial respiratório, a infecção por SARS-CoV-2 induz níveis significativamente mais baixos de interferons. E em junho deste ano, os pesquisadores relataram mutações na variante Alpha que parecem habilitá-la a controlar a produção de interferon de forma ainda mais eficiente.
“É claro que o SARS-CoV-2 é um vírus muito rápido que tem uma capacidade única de impedir que nosso sistema imunológico reconheça e combata a infecção nos primeiros estágios”, diz Stern-Ginossar. Quando o sistema imunológico percebe que existe um vírus, existe uma quantidade tão grande que as proteínas da resposta imunológica às vezes inundam a corrente sanguínea a uma taxa mais rápida do que o normal – o que pode causar danos. Os médicos perceberam no início da pandemia que algumas pessoas com COVID-19 que ficam muito doentes são prejudicadas por uma resposta imunológica hiperativa ao SARS-CoV-2, bem como pelo próprio vírus. Alguns tratamentos comprovados atuam atenuando essa resposta imunológica.
Estação de renovação
Depois que o vírus assume a tradução do hospedeiro, ele dá início a uma reforma doméstica, remodelando amplamente o interior e o exterior da célula de acordo com suas necessidades.
Primeiro, algumas das proteínas de pico viral recém-formadas viajam para a superfície da célula e se projetam para fora da membrana da célula hospedeira. Lá, eles ativam um canal de íon de cálcio do hospedeiro, que expulsa uma camada de gordura para fora da célula – a mesma camada encontrada nas células que se fundem naturalmente, como as células musculares. Nesse ponto, a célula infectada se funde com as células vizinhas que expressam ACE2, desenvolvendo-se em células respiratórias individuais massivas com até 20 núcleos.
Essas estruturas fundidas, chamadas de sincícios, são induzidas por infecções virais como o HIV e o vírus herpes simplex, mas não pelo vírus SARS, diz o biólogo molecular Mauro Giacca do King’s College London, que liderou a equipe que publicou a descoberta em 18 de abril. Ele levanta a hipótese de que a formação de sincícios permite que as células infectadas prosperem por longos períodos de tempo, produzindo mais e mais vírions. “Este não é um vírus de ataque e fuga”, diz ele. “Isso persiste.” Uma segunda equipe, liderada pelo pesquisador Qiang Sun da Academia Chinesa de Ciências Médicas em Pequim, descobriu que algumas células infectadas com COVID-19 até mesmo formam sincícios com linfócitos – uma das células imunológicas do próprio corpo19. Este é um mecanismo conhecido de evasão imunológica por células tumorais, mas não por vírus. Isso sugere que as células infectadas evitam a detecção imunológica simplesmente agarrando-se e fundindo-se com batedores imunológicos próximos.
No interior da célula, ainda mais mudanças estão ocorrendo. Como outros coronavírus, o SARS-CoV-2 transforma o retículo endoplasmático longo e fino (RE), uma rede de membranas planas envolvidas na síntese e transporte de proteínas, em esferas de membrana dupla, como se o RE estivesse soprando bolhas. Essas vesículas de membrana dupla (DMVs) podem fornecer um local seguro para o RNA viral ser replicado e traduzido, protegendo-o dos sensores imunológicos inatos na célula, mas essa hipótese ainda está sendo investigada.
As proteínas envolvidas na produção de DMVs podem ser bons alvos de drogas, porque parecem ser necessárias para a replicação viral. Por exemplo, uma proteína hospedeira, TMEM41B, é necessária para mobilizar o colesterol e outros lipídios para expandir as membranas ER de modo que todas as partes do vírus cabem dentro20. “Quando você tira o TMEM41B, ele tem um grande impacto na infecção”, disse Vineet Menachery, um pesquisador de coronavírus na University of Texas Medical Branch em Galveston, que estava envolvido na pesquisa. A proteína transmembrana Nsp3 do coronavírus também pode ser um alvo: ela cria um poro semelhante a uma coroa nas paredes dos DMVs para liberar o RNA viral recém-formado.
A maioria dos vírus que tem um invólucro externo, conhecido como envelope, forma esse recurso por montagem diretamente na borda da célula, cooptando parte da própria membrana plasmática da célula em seu caminho para fora. Mas as proteínas do coronavírus recém-criadas seguem um caminho diferente.
Durante anos, evidências sugeriram que os coronavírus são transportados para fora da célula através do complexo de Golgi, uma organela que funciona como uma agência de correio, embalando moléculas em membranas e enviando-as para outras partes da célula. Lá, o vírus forma um envelope lipídico da membrana do complexo de Golgi; Vírions recém-formados são então carregados dentro das vesículas de Golgi para a superfície da célula, onde são cuspidos para fora da célula, diz a virologista e bióloga Carolyn Machamer da Universidade Johns Hopkins em Baltimore, Maryland, que estudou coronavírus por 30 anos.
Mas em dezembro, a bióloga celular Nihal Altan-Bonnet do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos EUA em Bethesda, Maryland, e seus colegas relataram que haviam detectado coronavírus saindo da célula através de lisossomos – latas de lixo celulares cheias de enzimas que se decompõem cell parts. O bloqueio da via de secreção baseada em Golgi não parece afetar a quantidade de vírus infeccioso liberado, diz Altan-Bonnet. A evidência de sua equipe sugere que as proteínas virais formam um envelope por brotamento no ER e, em seguida, assumem os lisossomos para sair da célula. Os pesquisadores estão testando inibidores que bloqueiam o processo de saída lisossomal como potenciais candidatos antivirais.
Deixar uma célula através do Golgi ou dos lisossomas é lento e ineficiente em comparação com o brotamento de uma membrana plasmática, então os cientistas não sabem por que o SARS-CoV-2 faz isso. Machamer suspeita que a composição lipídica de um envelope derivado de Golgi ou lisossoma é de alguma forma mais benéfica para o vírus do que a da membrana plasmática. “Se entendêssemos essa parte um pouco melhor, haveria grandes oportunidades para novas terapias antivirais”, diz ela.
Última fatia
No caminho para fora da célula, mais um evento transforma esse vírus em um rolo compressor infeccioso: um rápido corte em um local de cinco aminoácidos prepara o vírus para atacar seu próximo alvo.
Onde outros coronavírus têm um único aminoácido arginina na junção das subunidades S1 e S2 do pico, o SARS-CoV-2 tem uma linha de cinco aminoácidos: prolina, arginina, arginina, alanina e arginina. “Como o local era incomum, focamos nele e descobrimos que, sim, o local é essencial para a invasão de células pulmonares”, diz Pöhlmann. Em maio de 2020, ele e seus colegas relataram que uma proteína da célula hospedeira chamada furina reconhece e corta essa cadeia de aminoácidos – e o corte é “essencial” para o vírus entrar nas células pulmonares humanas com eficiência.
Não é a primeira vez que os pesquisadores identificam um local de clivagem da furina em um vírus; vírus da gripe aviária altamente patogênicos também o têm, diz Barclay. Quando um colega enviou a Barclay uma cepa de SARS-CoV-2 em cultura que havia perdido espontaneamente o local de clivagem da furina, sua equipe descobriu que os furões infectados com essa cepa liberavam partículas virais em quantidades menores do que os infectados com a cepa pandêmica. não transmitir a infecção para animais próximos9. Ao mesmo tempo que a equipe de Barclay relatou seus resultados em um preprint de setembro de 2020, um estudo na Holanda também descobriu que o coronavírus com um local de clivagem de furina intacto entra nas células das vias aéreas humanas mais rápido do que aqueles sem ele.
Furin é suspeito de cortar o local em algum ponto durante a montagem do vírion, ou pouco antes da liberação. O momento pode explicar por que o vírus sai pelo Golgi ou pelos lisossomos, diz Tom Gallagher, virologista da Loyola University Chicago, em Illinois. “O vírus, uma vez montado, move-se para uma organela onde pode ser banhado na presença da protease furina.”
Ao cortar a ligação entre as subunidades S1 e S2, o corte de furina solta proteínas de pico de vírion para que durante a entrada na célula elas respondam a um segundo corte por TMPRSS2, que expõe a área hidrofóbica que rapidamente se enterra na membrana da célula hospedeira, diz Gallagher. Se os picos não forem pré-cortados por furin – e nem sempre – eles contornam o TMPRSS2 e entram pela via endossômica mais lenta, se o fizerem.
Duas variantes do coronavírus, Alpha e Delta, alteraram os locais de clivagem da furina. Na variante Alfa, o aminoácido prolina inicial é alterado para uma histidina (P681H); na variante Delta, é alterado para arginina (P681R). Ambas as mudanças tornam a sequência menos ácida e, quanto mais básica a cadeia de aminoácidos, mais eficazmente a furina a reconhece e corta, diz Barclay. “Nossa hipótese é que este seja o vírus cada vez melhor na transmissão.”
Mais cortes de furina significam mais proteínas de pico preparadas para entrar nas células humanas. No SARS-CoV, menos de 10% das proteínas de pico são preparadas, diz Menachery, cujo grupo de laboratório tem quantificado as proteínas de pico, mas ainda não publicou este trabalho. No SARS-CoV-2, esse percentual sobe para 50%. Na variante Alpha, é mais de 50%. Na variante Delta altamente transmissível, o grupo descobriu, mais de 75% dos picos são preparados para infectar uma célula humana.
Desconhecidos conhecidos
A comunidade científica ainda está arranhando a superfície de sua compreensão do SARS-CoV-2. As principais incógnitas incluem o número de receptores ACE2 necessários para se ligar a cada proteína de pico; quando exatamente o local S2 é clivado por TMPRSS2; e o número de picos necessários para a fusão vírus-membrana celular, diz McLellan – e isso é apenas para a entrada. Em abril de 2020, uma equipe da University of California, San Francisco, identificou pelo menos 332 interações entre SARS-CoV-2 e proteínas humanas.
Não é fácil acompanhar o ritmo do vírus em rápida mutação. A maioria das mutações até agora está associada com a eficácia com que o vírus se espalha, não com o quanto o vírus danifica o hospedeiro, concordam os especialistas. Este mês, um estudo relatou que a variante Delta cresceu mais rapidamente e em níveis mais elevados dentro dos pulmões e garganta das pessoas do que as versões anteriores do vírus.
Mas ainda não é certo como as mutações de Delta sobrecarregaram a variante dessa forma, diz Stern-Ginossar. “Isso é algo que muitos laboratórios estão tentando descobrir.”
Publicado em 29/07/2021 00h51
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