Um relatório técnico recente na Nature Cell Biology introduziu um novo método para examinar alterações específicas no DNA após a replicação. Os cientistas criaram um método quantitativo altamente sensível utilizando espectrometria de massa conhecido como iDEMS (isolamento de DNA por rotulagem EdU para espectrometria de massa).
“A novidade em nosso trabalho é que não usamos métodos de sequenciamento amplamente utilizados neste campo, em vez disso, usamos espectrometria de massa, que é a primeira vez que essa abordagem foi usada para medir modificações de DNA em DNA replicado e purificado”, diz o Dr. Stewart-Morgan, co-primeiro autor do relatório, do laboratório Groth no Centro da Fundação Novo Nordisk para Pesquisa de Proteínas (CPR) da Universidade de Copenhague.
Esta abordagem única é o resultado de um projeto conjunto com o laboratório Hajkova no MRC London Institute of Medical Sciences (LMS). “No laboratório Groth temos experiência em replicação e o laboratório Hajkova tem experiência em estudar a metilação do DNA por espectrometria de massa. Acho que essa colaboração multidisciplinar é em grande parte a razão do sucesso do projeto”, explica o Dr. Stewart-Morgan. “Os resultados de nossa pesquisa usando o iDEMS são definitivos e abrem novos caminhos para pesquisas futuras.”
Modificações do DNA e estabilidade celular
O genoma é todo o conjunto de instruções de DNA encontradas em uma célula. Praticamente todas as células de um organismo contêm a mesma informação genética – mas quais genes são expressos com base na função da célula. Essa expressão gênica específica da célula é regulada pelo epigenoma da célula, que consiste em proteínas ligadas ao DNA, bem como modificações químicas diretas no DNA. Um dos reguladores epigenéticos mais importantes é a metilação do DNA – um marcador químico que desativa regiões do genoma que não deveriam ser expressas. O padrão desses marcadores é muito importante para manter a estabilidade e a identidade de uma célula: por exemplo, a metilação do DNA em uma célula hepática será diferente do padrão de metilação do DNA em uma célula sanguínea.
Quando o DNA é replicado durante a divisão celular, as marcas epigenéticas associadas ao DNA, incluindo a metilação do DNA, são diluídas. As cadeias de DNA recém-criadas precisam restabelecer o nível e o padrão de metilação para manter o controle da expressão gênica, a estabilidade genômica e a memória epigenética da identidade da célula.
No entanto, muito sobre esse processo é desconhecido, e a perda de metilação do DNA é uma característica comum em células que se dividiram muitas vezes, como células cancerígenas que são muito proliferativas e células envelhecidas que se replicaram muitas vezes ao longo da vida de uma pessoa. Nos últimos anos, vários grupos tentaram investigar esse processo usando métodos de sequenciamento, no entanto, a cinética exata da manutenção da metilação pós-replicativa permaneceu obscura.
Restabelecimento da metilação
Usando o iDEMS, os pesquisadores descobriram que os níveis de metilação do DNA aumentam constantemente após a replicação e, após 4 horas, os níveis no DNA replicado e no DNA genômico eram iguais. Isso indica que esse processo prossegue em um ritmo constante e lento. No entanto, é superado pela divisão celular.
“Com o tempo, as células não têm tempo suficiente para restabelecer sua metilação após a replicação, e a metilação do genoma acaba se diluindo. Esta é a primeira vez que uma cinética muito clara para o restabelecimento da metilação foi mostrada. Além disso, vimos a quantificação absoluta dos níveis de metilação do DNA, permitindo-nos distinguir quais marcas de metilação foram recém-estabelecidas. Isso nos deu confiança em nossas medições cinéticas”, relata o Dr. Stewart-Morgan.
Um segundo marcador químico
Os pesquisadores também usaram o iDEMS para estudar um segundo marcador – a hidroximetilação do DNA – que é um marcador genômico muito mais raro do que a metilação. Seus resultados corroboraram pesquisas anteriores, diz o Dr. Stewart-Morgan: “Descobrimos que uma fita de DNA, a matriz ou fita ‘parental’, sempre tem mais hidroximetilação do que a outra fita ‘filha’, apoiando trabalhos anteriores que indicavam que esse marcador distingue o DNA fios com base na idade “, diz ela.
“No entanto, também descobrimos que não há um ponto em que os níveis de hidroximetilação sejam iguais entre as fitas parental e filha ao longo do ciclo celular. Isso abre novas questões sobre como essa diferença entre os filamentos pode ser usada pelas células, por exemplo, durante o reparo do DNA”.
O potencial do iDEMS
Ao quantificar diretamente as modificações do DNA no DNA replicado, o iDEMS resolve a cinética de metilação e hidroximetilação do DNA após a replicação do DNA. “O iDEMS é uma ferramenta dinâmica e informativa para abordar questões importantes na manutenção do epigenoma e na biologia da modificação do DNA”, diz o Dr. Stewart-Morgan.
Olhando para o futuro, o iDEMS será útil no perfil da dinâmica de metilação e hidroximetilação em diferentes contextos celulares, incluindo envelhecimento e evolução do câncer. Em comparação com os dados de sequenciamento, a espectrometria de massa fornece uma leitura simples e rápida e, portanto, o iDEMS pode ser útil onde a eficiência é fundamental, como em ambientes médicos e estudos de descoberta de medicamentos.
“Nossos resultados destacam a importância de novos métodos para entender a biologia através de mais de uma lente. O iDEMS é extremamente flexível, pois pode ser combinado com outros métodos estabelecidos usados em biologia molecular para observar o epigenoma. Esse método, portanto, adiciona uma ferramenta importante ao conjunto de tecnologias que investigam a estabilidade do epigenoma”, conclui o Dr. Stewart-Morgan.
Publicado em 22/02/2023 21h06
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