As telas genéticas baseadas no CRISPR ajudaram os cientistas a identificar genes que são atores-chave na anemia falciforme, imunoterapia contra o câncer, metástase do câncer de pulmão e muitas outras doenças. No entanto, essas telas genéticas são limitadas em escopo: elas só podem editar ou direcionar o DNA. Para muitas regiões do genoma humano, o direcionamento ao DNA pode não ser eficaz, e outros organismos, como vírus de RNA como coronavírus ou gripe, não podem ser direcionados de maneira alguma com as telas CRISPR direcionadas ao DNA existentes.
Agora, em um novo recurso importante para a comunidade científica publicado hoje na Nature Biotechnology, pesquisadores do laboratório de Neville Sanjana, Ph.D., no New York Genome Center e na New York University desenvolveram um novo tipo de tecnologia de tela CRISPR para RNA alvo.
Os pesquisadores capitalizaram uma enzima CRISPR recentemente caracterizada chamada Cas13, que tem como alvo o RNA ao invés do DNA. Usando Cas13, eles projetaram uma plataforma otimizada para triagens genéticas paralelas em massa no nível do RNA nas células humanas. Essa tecnologia de triagem pode ser usada para entender muitos aspectos da regulação do RNA e identificar a função dos RNAs não codificadores, que são moléculas de RNA produzidas, mas que não codificam proteínas.
Ao direcionar milhares de locais diferentes nos transcritos de RNA humano, os pesquisadores desenvolveram um modelo preditivo baseado em machine learning para agilizar a identificação dos RNAs guia Cas13 mais eficazes. A nova tecnologia está disponível para pesquisadores através de um site interativo e uma caixa de ferramentas de código aberto para prever a eficiência do RNA guia para alvos personalizados de RNA e fornece RNAs guia pré-projetados para todos os genes de codificação de proteínas humanas.
“Prevemos que as enzimas Cas13 direcionadas a RNA terão um grande impacto na biologia molecular e nas aplicações médicas, mas pouco se sabe sobre o projeto de RNA guia para alta eficácia na segmentação”, disse o Dr. Sanjana, autor sênior do estudo. “Começamos a mudar isso por meio de um estudo aprofundado e sistemático para desenvolver princípios-chave e modelagem preditiva para um design de guia mais eficaz”.
Dr. Sanjana é membro do corpo docente do New York Genome Center, professor assistente de biologia na Universidade de Nova York e professor assistente de neurociência e fisiologia na NYU School of Medicine.
As enzimas Cas13 são enzimas do tipo VI CRISPR (repetições palindrômicas curtas e regularmente espaçadas) que foram recentemente identificadas como proteínas programáveis direcionadas a RNA e direcionadas a RNA com atividade de nuclease que permite a derrubada do gene alvo sem alterar o genoma. Essa propriedade faz do Cas13 uma terapêutica potencialmente significativa para influenciar a expressão gênica sem alterar permanentemente a sequência do genoma.
“Este é o tipo de inovação tecnológica que promovemos e desenvolvemos no New York Genome Center. Esta última tecnologia CRISPR do Sanjana Lab tem implicações empolgantes para avançar nos campos da genômica e medicina de precisão”, disse Tom Maniatis, Ph.D. , Diretor científico da família Evnin e diretor executivo do New York Genome Center.
Cientista de pós-doutorado Hans-Hermann Wessels e Ph.D. O aluno Alejandro Méndez-Mancilla, co-primeiro autor do estudo, desenvolveu um conjunto de novas ferramentas baseadas em Cas13 e conduziu uma tela de transcrição de lado a lado e permutação em células de mamíferos. No total, os pesquisadores reuniram informações para mais de 24.000 guias de direcionamento de RNA.
“Colocamos RNAs guia em vários transcritos diferentes, incluindo vários genes humanos, onde poderíamos medir facilmente a transcrição por coloração de anticorpos e citometria de fluxo”, disse o Dr. Wessels. “Ao longo do caminho, descobrimos algumas idéias biológicas interessantes que podem expandir a aplicação de enzimas Cas13 direcionadas a RNA”.
Entre as descobertas da equipe, por exemplo, estão informações sobre quais regiões do RNA guia são mais importantes para o reconhecimento de um RNA alvo. Usando milhares de RNAs de guia com incompatibilidades de 1, 2 ou 3 letras simples para o RNA alvo, eles identificaram uma região “semente” crítica que é primorosamente sensível a incompatibilidades entre o guia CRISPR e o alvo. Essa descoberta ajudará os cientistas a projetar RNAs guia para evitar atividades fora do alvo em RNAs alvo não intencionais. Como uma célula humana típica expressa aproximadamente 100.000 RNAs, o direcionamento preciso de Cas13 apenas do alvo pretendido é vital para triagem e aplicações terapêuticas.
Além de aprofundar nosso entendimento sobre os alvos fora de Cas13, a região “semente” poderia ser usada para biossensores de próxima geração que possam discriminar com mais precisão entre espécies de RNA intimamente relacionadas. No total, este estudo aumenta o número de pontos de dados de estudos anteriores Cas13 em células de mamíferos em mais de duas ordens de magnitude.
“Estamos particularmente empolgados em usar o sistema de triagem Cas13 otimizado para atingir RNAs não codificantes”, disse o co-primeiro autor Méndez-Mancilla. “Isso expande muito a caixa de ferramentas CRISPR para telas genéticas e transcriptômicas avançadas”. No estudo, os pesquisadores notaram uma diferença acentuada no knockdown de proteínas ao direcionar diferentes elementos de codificação e não codificação de proteínas de RNAs mensageiros e encontraram evidências de que Cas13 compete com outras proteínas de ligação a RNA envolvidas no processamento e processamento de transcrições.
A equipe recentemente alavancou seu modelo preditivo de RNA guia para uma análise particularmente crítica: a emergência de saúde pública do COVID-19 é devido a um coronavírus, que contém um genoma de RNA – e não de DNA. Usando o modelo derivado de suas telas massivamente paralelas, os pesquisadores identificaram RNAs guia ótimos que poderiam ser usados para detecção futura e aplicações terapêuticas.
Publicado em 17/03/2020 05h13
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