Na última década, o sistema de edição de genes CRISPR-Cas9 revolucionou a engenharia genética, permitindo aos cientistas fazer mudanças direcionadas no DNA dos organismos. Embora o sistema possa ser potencialmente útil no tratamento de uma variedade de doenças, a edição do CRISPR-Cas9 envolve o corte de fitas de DNA, levando a mudanças permanentes no material genético da célula.
Agora, em um artigo publicado online na Cell em 9 de abril, os pesquisadores descrevem uma nova tecnologia de edição de genes chamada CRISPRoff, que permite aos pesquisadores controlar a expressão do gene com alta especificidade, deixando a sequência do DNA inalterada. Desenhado pelo membro do Whitehead Institute Jonathan Weissman, pelo professor assistente Luke Gilbert da University of California San Francisco, pelo pós-doutorado do laboratório de Weissman James Nuñez e colaboradores, o método é estável o suficiente para ser herdado por centenas de divisões celulares e também é totalmente reversível.
“A grande história aqui é que agora temos uma ferramenta simples que pode silenciar a grande maioria dos genes”, diz Weissman, que também é professor de biologia no MIT e investigador do Howard Hughes Medical Institute. “Podemos fazer isso para vários genes ao mesmo tempo, sem nenhum dano ao DNA, com grande homogeneidade e de uma forma que pode ser revertida. É uma ótima ferramenta para controlar a expressão gênica.”
O projeto foi parcialmente financiado por uma bolsa de 2017 da Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa para criar um editor reversível de genes. “Avance quatro anos [a partir da concessão inicial] e CRISPRoff finalmente funcionará como previsto de uma forma de ficção científica”, diz o co-autor sênior Gilbert. “É emocionante ver como funciona tão bem na prática.”
Engenharia Genética 2.0
O sistema CRISPR-Cas9 clássico usa uma proteína de corte de DNA chamada Cas9, encontrada no sistema imunológico bacteriano. O sistema pode ser direcionado para genes específicos em células humanas usando um único RNA guia, onde as proteínas Cas9 criam pequenas quebras na fita de DNA. Então, o maquinário de reparo existente na célula remende os buracos.
Como esses métodos alteram a sequência de DNA subjacente, eles são permanentes. Além disso, sua confiança em mecanismos de reparo celular “internos” significa que é difícil limitar o resultado a uma única mudança desejada. “Por mais bonito que seja o CRISPR-Cas9, ele dispensa o reparo dos processos celulares naturais, que são complexos e multifacetados”, diz Weissman. “É muito difícil controlar os resultados.”
Foi aí que os pesquisadores viram uma oportunidade para um tipo diferente de editor de genes – um que não alterasse as próprias sequências de DNA, mas mudasse a forma como eram lidas na célula.
Esse tipo de modificação é o que os cientistas chamam de “epigenética” – os genes podem ser silenciados ou ativados com base em mudanças químicas na fita de DNA. Problemas com a epigenética de uma célula são responsáveis por muitas doenças humanas, como a síndrome do X Frágil e vários tipos de câncer, e podem ser transmitidos de geração a geração.
O silenciamento do gene epigenético geralmente funciona por meio da metilação – a adição de marcadores químicos a certos locais na fita de DNA – que faz com que o DNA se torne inacessível à RNA polimerase, a enzima que lê a informação genética na sequência de DNA em transcritos de RNA mensageiro, que podem, em última análise, ser os projetos de proteínas.
Weissman e colaboradores haviam criado anteriormente dois outros editores epigenéticos chamados CRISPRi e CRISPRa – mas ambos vinham com uma ressalva. Para que funcionem nas células, as células precisam expressar continuamente proteínas artificiais para manter as mudanças.
“Com esta nova tecnologia CRISPRoff, você pode [expressar uma proteína brevemente] para escrever um programa que é lembrado e executado indefinidamente pela célula”, diz Gilbert. “Isso muda o jogo, então agora você está basicamente escrevendo uma mudança que é passada através das divisões de células – de algumas maneiras, podemos aprender a criar uma versão 2.0 do CRISPR-Cas9 que é mais segura e eficaz, e pode fazer tudo isso outras coisas também. ”
Construindo o switch
Para construir um editor epigenético que pudesse imitar a metilação natural do DNA, os pesquisadores criaram uma minúscula máquina de proteína que, guiada por pequenos RNAs, pode agregar grupos metil em pontos específicos da fita. Esses genes metilados são então “silenciados” ou desligados, daí o nome CRISPRoff.
Como o método não altera a sequência da fita de DNA, os pesquisadores podem reverter o efeito silenciador usando enzimas que removem os grupos metil, um método que eles chamaram de CRISPRon.
Enquanto testavam o CRISPRoff em diferentes condições, os pesquisadores descobriram alguns recursos interessantes do novo sistema. Por um lado, eles poderiam direcionar o método para a grande maioria dos genes do genoma humano – e funcionou não apenas para os próprios genes, mas também para outras regiões do DNA que controlam a expressão gênica, mas não codificam proteínas. “Foi um choque enorme até para nós, porque pensamos que só seria aplicável a um subconjunto de genes”, diz o primeiro autor Nuñez.
Além disso, surpreendentemente para os pesquisadores, o CRISPRoff foi capaz de silenciar genes que não tinham grandes regiões metiladas chamadas ilhas CpG, que antes eram consideradas necessárias para qualquer mecanismo de metilação do DNA.
“O que se pensava antes deste trabalho era que 30 por cento dos genes que não têm uma ilha CpG não eram controlados pela metilação do DNA”, diz Gilbert. “Mas nosso trabalho mostra claramente que você não precisa de uma ilha CpG para desligar os genes por metilação. Isso, para mim, foi uma grande surpresa.”
CRISPRoff em pesquisa e terapia
Para investigar o potencial do CRISPRoff para aplicações práticas, os cientistas testaram o método em células-tronco pluripotentes induzidas. Essas são células que podem se transformar em incontáveis tipos de células no corpo, dependendo do coquetel de moléculas às quais são expostas e, portanto, são modelos poderosos para estudar o desenvolvimento e a função de determinados tipos de células.
Os pesquisadores escolheram um gene para silenciar nas células-tronco e então as induziram a se transformar em células nervosas chamadas neurônios. Quando procuraram o mesmo gene nos neurônios, descobriram que ele havia permanecido silenciado em 90 por cento das células, revelando que as células retêm uma memória das modificações epigenéticas feitas pelo sistema CRISPRoff, mesmo quando mudam o tipo de célula.
Eles também selecionaram um gene para usar como exemplo de como o CRISPRoff pode ser aplicado à terapêutica: o gene que codifica a proteína Tau, que está implicada na doença de Alzheimer. Depois de testar o método em neurônios, eles foram capazes de mostrar que o uso de CRISPRoff poderia ser usado para diminuir a expressão de Tau, embora não totalmente. “O que mostramos é que esta é uma estratégia viável para silenciar Tau e evitar que a proteína se expresse”, diz Weissman. “A questão é, então, como entregar isso a um adulto? E seria realmente o suficiente para impactar o Alzheimer? Essas são grandes questões em aberto, especialmente a última.”
Mesmo que CRISPRoff não leve a terapias de Alzheimer, existem muitas outras condições às quais ele poderia ser aplicado. E embora a entrega a tecidos específicos continue sendo um desafio para tecnologias de edição de genes, como CRISPRoff, “mostramos que você pode entregá-la transitoriamente como DNA ou RNA, a mesma tecnologia que é a base da vacina contra coronavírus Moderna e BioNTech”, Weissman diz.
Weissman, Gilbert e colaboradores estão entusiasmados com o potencial do CRISPRoff para pesquisa também. “Já que agora podemos silenciar qualquer parte do genoma que quisermos, é uma ótima ferramenta para explorar a função do genoma”, diz Weissman.
Além disso, ter um sistema confiável para alterar a epigenética de uma célula pode ajudar os pesquisadores a aprender os mecanismos pelos quais as modificações epigenéticas são transmitidas através das divisões celulares. “Acho que nossa ferramenta realmente nos permite começar a estudar o mecanismo da herdabilidade, especialmente a herdabilidade epigenética, que é uma grande questão nas ciências biomédicas”, diz Nuñez.
Publicado em 12/04/2021 08h20
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