Com base no sistema de edição de genes CRISPR, os pesquisadores do MIT projetaram uma nova ferramenta que pode cortar genes defeituosos e substituí-los por novos, de maneira mais segura e eficiente.
Usando esse sistema, os pesquisadores mostraram que poderiam fornecer genes de até 36.000 pares de bases de DNA para vários tipos de células humanas, bem como para células hepáticas em camundongos. A nova técnica, conhecida como PASTE, pode ser promissora no tratamento de doenças causadas por genes defeituosos com um grande número de mutações, como a fibrose cística.
“É uma nova maneira genética de potencialmente atingir essas doenças realmente difíceis de tratar”, diz Omar Abudayyeh, McGovern Fellow do McGovern Institute for Brain Research do MIT. “Queríamos trabalhar para o que a terapia genética deveria fazer em seu início original, que é substituir genes, não apenas corrigir mutações individuais”.
A nova ferramenta combina o direcionamento preciso do CRISPR-Cas9, um conjunto de moléculas originalmente derivadas de sistemas de defesa bacteriana, com enzimas chamadas integrases, que os vírus usam para inserir seu próprio material genético em um genoma bacteriano.
“Assim como o CRISPR, essas integrases vêm da batalha contínua entre as bactérias e os vírus que as infectam”, diz Jonathan Gootenberg, também McGovern Fellow. “Isso fala de como podemos continuar encontrando uma abundância de novas ferramentas interessantes e úteis desses sistemas naturais”.
Gootenberg e Abudayyeh são os principais autores do novo estudo, que aparece hoje na Nature Biotechnology. Os principais autores do estudo são os associados técnicos do MIT Matthew Yarnall e Rohan Krajeski, a ex-estudante de pós-graduação do MIT Eleonora Ioannidi e o estudante de pós-graduação do MIT Cian Schmitt-Ulms.
Inserção de DNA
O sistema de edição de genes CRISPR-Cas9 consiste em uma enzima de corte de DNA chamada Cas9 e uma fita curta de RNA que guia a enzima para uma área específica do genoma, direcionando a Cas9 para onde fazer seu corte. Quando Cas9 e o RNA guia direcionado a um gene da doença são entregues às células, um corte específico é feito no genoma e os processos de reparo do DNA das células colam o corte novamente, muitas vezes excluindo uma pequena porção do genoma.
Se um modelo de DNA também for entregue, as células podem incorporar uma cópia corrigida em seus genomas durante o processo de reparo. No entanto, esse processo exige que as células façam quebras de fita dupla em seu DNA, o que pode causar deleções ou rearranjos cromossômicos prejudiciais às células. Outra limitação é que ele só funciona em células que estão se dividindo, pois as células que não se dividem não têm processos ativos de reparo do DNA.
A equipe do MIT queria desenvolver uma ferramenta que pudesse cortar um gene defeituoso e substituí-lo por um novo sem induzir nenhuma quebra de fita dupla no DNA. Para atingir esse objetivo, eles se voltaram para uma família de enzimas chamadas integrases, que os vírus chamados bacteriófagos usam para se inserir em genomas bacterianos.
Para este estudo, os pesquisadores se concentraram em integrases de serina, que podem inserir grandes pedaços de DNA, tão grandes quanto 50.000 pares de bases. Essas enzimas têm como alvo sequências genômicas específicas conhecidas como sítios de fixação, que funcionam como “plataformas de aterrissagem”. Quando eles encontram a plataforma de pouso correta no genoma do hospedeiro, eles se ligam a ela e integram sua carga útil de DNA.
Em trabalhos anteriores, os cientistas acharam desafiador desenvolver essas enzimas para terapia humana porque as plataformas de pouso são muito específicas e é difícil reprogramar integrases para atingir outros locais. A equipe do MIT percebeu que combinar essas enzimas com um sistema CRISPR-Cas9 que insere o local de pouso correto permitiria uma reprogramação fácil do poderoso sistema de inserção.
A nova ferramenta, PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements), inclui uma enzima Cas9 que corta em um sítio genômico específico, guiado por uma fita de RNA que se liga a esse sítio. Isso lhes permite direcionar qualquer sítio no genoma para inserção do sítio de aterrissagem, que contém 46 pares de bases de DNA. Essa inserção pode ser feita sem a introdução de quebras de fita dupla, adicionando uma fita de DNA primeiro por meio de uma transcriptase reversa fundida, depois sua fita complementar.
Uma vez que o local de pouso é incorporado, a integrase pode vir e inserir sua carga útil de DNA muito maior no genoma desse local.
“Achamos que este é um grande passo para alcançar o sonho de inserção programável de DNA”, diz Gootenberg. “É uma técnica que pode ser facilmente adaptada tanto ao local que queremos integrar quanto à carga.”
Reposição de genes
Neste estudo, os pesquisadores mostraram que poderiam usar o PASTE para inserir genes em vários tipos de células humanas, incluindo células hepáticas, células T e linfoblastos (glóbulos brancos imaturos). Eles testaram o sistema de entrega com 13 genes de carga útil diferentes, incluindo alguns que poderiam ser terapeuticamente úteis, e conseguiram inseri-los em nove locais diferentes no genoma.
Nessas células, os pesquisadores conseguiram inserir genes com uma taxa de sucesso que varia de 5 a 60 por cento. Esta abordagem também rendeu muito poucos “indels” indesejados (inserções ou deleções) nos locais de integração do gene.
“Nós vemos muito poucos indels e, como não estamos fazendo quebras de fita dupla, você não precisa se preocupar com rearranjos cromossômicos ou deleções de braços cromossômicos em grande escala”, diz Abudayyeh.
Os pesquisadores também demonstraram que poderiam inserir genes em fígados “humanizados” em camundongos. Os fígados desses camundongos consistem em cerca de 70% de hepatócitos humanos, e o PASTE integrou com sucesso novos genes em cerca de 2,5% dessas células.
As sequências de DNA que os pesquisadores inseriram neste estudo tinham até 36.000 pares de bases, mas eles acreditam que sequências ainda mais longas também poderiam ser usadas. Um gene humano pode variar de algumas centenas a mais de 2 milhões de pares de bases, embora para fins terapêuticos seja necessário utilizar apenas a sequência codificadora da proteína, reduzindo drasticamente o tamanho do segmento de DNA que precisa ser inserido no genoma.
Os pesquisadores agora estão explorando ainda mais a possibilidade de usar essa ferramenta como uma possível maneira de substituir o gene defeituoso da fibrose cística. Essa técnica também pode ser útil para tratar doenças do sangue causadas por genes defeituosos, como hemofilia e deficiência de G6PD, ou doença de Huntington, um distúrbio neurológico causado por um gene defeituoso que possui muitas repetições de genes.
Os pesquisadores também disponibilizaram suas construções genéticas online para outros cientistas usarem.
“Uma das coisas fantásticas sobre a engenharia dessas tecnologias moleculares é que as pessoas podem construí-las, desenvolvê-las e aplicá-las de maneiras que talvez não pensamos ou não consideramos”, diz Gootenberg. “É realmente ótimo fazer parte dessa comunidade emergente.”
Publicado em 28/11/2022 09h58
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