Embora o sistema de edição de genes CRISPR-Cas9 tenha se tornado o garoto-propaganda da inovação em biologia sintética, ele tem algumas limitações importantes. O CRISPR-Cas9 pode ser programado para encontrar e cortar pedaços específicos de DNA, mas editar o DNA para criar as mutações desejadas exige que a célula use um novo pedaço de DNA para reparar a quebra. Essa isca e troca pode ser complicada de orquestrar e pode até ser tóxica para as células porque o Cas9 frequentemente corta também locais não intencionais e fora do alvo.
Em vez disso, técnicas alternativas de edição de genes, chamadas de recombineering, executam essa isca e troca, introduzindo um pedaço alternativo de DNA enquanto uma célula replica seu genoma, criando mutações genéticas de forma eficiente sem quebrar o DNA. Esses métodos são simples o suficiente para que possam ser usados em muitas células ao mesmo tempo para criar conjuntos complexos de mutações para os pesquisadores estudarem. Descobrir quais são os efeitos dessas mutações, no entanto, requer que cada mutante seja isolado, sequenciado e caracterizado: uma tarefa demorada e impraticável.
Pesquisadores do Wyss Institute for Biologicamente Inspired Engineering da Harvard University e da Harvard Medical School (HMS) criaram uma nova ferramenta de edição de genes chamada Retron Library Recombineering (RLR) que torna essa tarefa mais fácil. O RLR gera até milhões de mutações simultaneamente e “códigos de barras” células mutantes para que todo o pool possa ser rastreado de uma vez, permitindo que grandes quantidades de dados sejam facilmente gerados e analisados. A conquista, que foi alcançada em células bacterianas, é descrita em um artigo recente na PNAS.
“O RLR nos permitiu fazer algo impossível de fazer com o CRISPR: cortamos aleatoriamente um genoma bacteriano, transformamos esses fragmentos genéticos em DNA de fita simples in situ e os usamos para rastrear milhões de sequências simultaneamente”, disse o co-autor Max Schubert, Ph.D., pós-doutorado no laboratório de George Church, membro do corpo docente Wyss. “RLR é uma ferramenta de edição de genes mais simples e flexível que pode ser usada para experimentos altamente multiplexados, o que elimina a toxicidade frequentemente observada com CRISPR e melhora a capacidade dos pesquisadores de explorar mutações no nível do genoma.”
Retrons: do enigma à ferramenta de engenharia
Retrons são segmentos de DNA bacteriano que sofrem transcrição reversa para produzir fragmentos de DNA de fita simples (ssDNA). A existência de retrons é conhecida há décadas, mas a função do ssDNA eles produzem cientistas confusos da década de 1980 até junho de 2020, quando uma equipe finalmente descobriu que retron ssDNA detecta se um vírus infectou a célula, formando parte do sistema imunológico bacteriano sistema.
Embora os retrons fossem originalmente vistos como simplesmente uma peculiaridade misteriosa das bactérias, os pesquisadores ficaram mais interessados neles nos últimos anos porque eles, como o CRISPR, poderiam ser usados para edição precisa e flexível de genes em bactérias, leveduras e até mesmo em células humanas.
“Por muito tempo, o CRISPR foi considerado uma coisa estranha que as bactérias faziam, e descobrir como aproveitá-lo para a engenharia do genoma mudou o mundo. Retrons são outra inovação bacteriana que também pode fornecer alguns avanços importantes”, disse Schubert. Seu interesse em retrons foi despertado há vários anos por causa de sua capacidade de produzir ssDNA em bactérias – um recurso atraente para uso em um processo de edição de genes chamado recombineering de oligonucleotídeo.
As técnicas de edição de genes baseadas em recombinação requerem a integração de ssDNA contendo uma mutação desejada no DNA de um organismo, o que pode ser feito de duas maneiras. O DNA de fita dupla pode ser cortado fisicamente (com CRISPR-Cas9, por exemplo) para induzir a célula a incorporar a sequência mutante em seu genoma durante o processo de reparo, ou a fita de DNA mutante e uma proteína de anelamento de fita simples (SSAP) podem ser introduzido em uma célula que está se replicando, de modo que o SSAP incorpore a fita mutante no DNA das células-filhas.
“Descobrimos que os retrons deveriam nos dar a capacidade de produzir ssDNA dentro das células que queremos editar, em vez de tentar forçá-los a entrar na célula de fora, e sem danificar o DNA nativo, que são qualidades muito atraentes”, disse -primeiro autor Daniel Goodman, Ph.D., ex-Graduate Research Fellow no Wyss Institute que agora é Jane Coffin Childs Postdoctoral Fellow na UCSF.
Outra atração dos retrons é que suas próprias sequências podem servir como “códigos de barras” que identificam quais indivíduos dentro de um pool de bactérias receberam cada sequência de retrons, permitindo telas em pool dramaticamente mais rápidas de cepas mutantes criadas com precisão.
Para ver se eles poderiam realmente usar retrons para conseguir recombineering eficiente com retrons, Schubert e seus colegas primeiro criaram plasmídeos circulares de DNA bacteriano que continham genes de resistência a antibióticos colocados dentro de sequências de retrons, bem como um gene SSAP para permitir a integração da sequência de retrons em o genoma bacteriano. Eles inseriram esses plasmídeos retron em bactérias E. coli para ver se os genes foram integrados com sucesso em seus genomas após 20 gerações de replicação celular. Inicialmente, menos de 0,1% de E. coli com o sistema de recombinação de retrons incorporou a mutação desejada.
Para melhorar esse desempenho inicial decepcionante, a equipe fez vários ajustes genéticos na bactéria. Primeiro, eles inativaram o mecanismo de reparo de incompatibilidade natural das células, que corrige os erros de replicação do DNA e poderia, portanto, “consertar” as mutações desejadas antes que pudessem ser passadas para a próxima geração. Eles também desativaram dois genes bacterianos que codificam para exonucleases – enzimas que destroem o ssDNA de flutuação livre. Essas mudanças aumentaram dramaticamente a proporção de bactérias que incorporaram a sequência retrônica, para mais de 90% da população.
Tags de nome para mutantes
Agora que estavam confiantes de que seus retrons ssDNA foram incorporados aos genomas de suas bactérias, a equipe testou se poderiam usar os retrons como um “atalho” de sequenciamento genético, permitindo que muitos experimentos fossem realizados em uma mistura. Como cada plasmídeo tinha sua própria sequência retron única que pode funcionar como uma “etiqueta de nome”, eles raciocinaram que deveriam ser capazes de sequenciar o retron muito mais curto, em vez de todo o genoma bacteriano, para determinar qual mutação as células receberam.
Primeiro, a equipe testou se RLR poderia detectar mutações conhecidas de resistência a antibióticos em E. coli. Eles descobriram que sim – sequências de retrons contendo essas mutações estavam presentes em proporções muito maiores em seus dados de sequenciamento em comparação com outras mutações. A equipe também determinou que RLR era sensível e preciso o suficiente para medir pequenas diferenças na resistência que resultam de mutações muito semelhantes. Crucialmente, reunir esses dados sequenciando códigos de barras de todo o pool de bactérias, em vez de isolar e sequenciar mutantes individuais, acelera drasticamente o processo.
Então, os pesquisadores levaram o RLR um passo adiante para ver se ele poderia ser usado em DNA fragmentado aleatoriamente e descobrir quantos retrons eles poderiam usar de uma vez. Eles cortaram o genoma de uma cepa de E. coli altamente resistente a outro antibiótico e usaram esses fragmentos para construir uma biblioteca de dezenas de milhões de sequências genéticas contidas em sequências de retrons em plasmídeos. “A simplicidade do RLR realmente brilhou neste experimento, porque nos permitiu construir uma biblioteca muito maior do que a que podemos usar atualmente com o CRISPR, na qual temos que sintetizar um guia e uma sequência de DNA doador para induzir cada mutação,” disse Schubert.
Esta biblioteca foi então introduzida na cepa E coli otimizada com RLR para análise. Mais uma vez, os pesquisadores descobriram que os retrons que conferem resistência aos antibióticos podem ser facilmente identificados pelo fato de que foram enriquecidos em relação a outros quando o pool de bactérias foi sequenciado.
“Ser capaz de analisar bibliotecas mutantes com código de barras agrupadas com RLR permite que milhões de experimentos sejam realizados simultaneamente, permitindo-nos observar os efeitos das mutações em todo o genoma, bem como como essas mutações podem interagir umas com as outras”, disse o autor sênior George Church, que lidera a área de enfoque de Biologia Sintética do Wyss Institute e também é professor de genética no HMS. “Este trabalho ajuda a estabelecer um roteiro para o uso de RLR em outros sistemas genéticos, o que abre muitas possibilidades interessantes para pesquisas genéticas futuras.”
Outra característica que distingue RLR de CRISPR é que a proporção de bactérias que integram com sucesso uma mutação desejada em seu genoma aumenta ao longo do tempo conforme a bactéria se replica, enquanto o método “one shot” do CRISPR tende a ter sucesso ou falhar na primeira tentativa. O RLR pode ser potencialmente combinado com o CRISPR para melhorar seu desempenho de edição ou pode ser usado como uma alternativa em muitos sistemas nos quais o CRISPR é tóxico.
Ainda há mais trabalho sendo feito no RLR para melhorar e padronizar a taxa de edição, mas o entusiasmo está crescendo com essa nova ferramenta. A natureza simples e otimizada do RLR pode permitir o estudo de como várias mutações interagem entre si e a geração de um grande número de pontos de dados que podem permitir o uso de machine learning para prever efeitos mutacionais adicionais.
“Esta nova ferramenta de biologia sintética leva a engenharia do genoma a níveis ainda mais elevados de rendimento, o que sem dúvida levará a inovações novas, empolgantes e inesperadas”, disse Don Ingber, M.D., Ph.D., Diretor Fundador do Wyss Institute. Ingber é também Professor Judah Folkman de Biologia Vascular no HMS e Hospital Infantil de Boston, e Professor de Bioengenharia na Escola de Engenharia e Ciências Aplicadas de Harvard John A. Paulson.
Publicado em 01/05/2021 14h36
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