Embora o sistema CRISPR / Cas9 tenha visto ampla aplicação na edição do genoma nuclear, usá-lo para editar o genoma mitocondrial tem sido problemático. Os principais obstáculos têm sido a falta de locais de edição adequados no pequeno mtDNA e a dificuldade tradicional de importar o RNA guia para a matriz mitocondrial onde os nucleoides podem ser acessados.
Dois artigos publicados recentemente sugerem que um progresso significativo está sendo feito em ambas as frentes. O primeiro artigo, publicado na revista SCIENCE CHINA Life Sciences, usou técnicas CRISPR para induzir eventos de inserção / deleção (InDel) em várias regiões microhomólogas de mtDNA. Esses eventos InDel foram desencadeados especificamente por lesões de quebra de fita dupla (DSB). Os autores descobriram que a mutagênese InDel foi significativamente melhorada pela multiplexação de sgRNA e um inibidor de reparo DSB chamado iniparib, sugerindo uma religação dos mecanismos de reparo DSB para manipular o mtDNA. No segundo artigo, publicado na revista Trends in Molecular Medicine, os pesquisadores dão uma visão global dos avanços recentes em diferentes formas de edição do genoma nuclear e mitocondrial.
Para obter mais informações sobre alguns desses novos desenvolvimentos, procurei Payam Gammage, um especialista em edição mitocondrial com um histórico comprovado no aperfeiçoamento de uma tecnologia de edição ligeiramente diferente baseada em nucleases de dedo de zinco (ZFNs). Essas nucleases são capazes de direcionar mitocôndrias de fita dupla para clivagem em localizações precisas de pares de bases e, portanto, podem eliminar mitocôndrias heteroplasmáticas que têm nucleoides defeituosos. Mais recentemente, Payam descobriu que 25 dos 30 genes mais mutados encontrados no câncer são encontrados no mtDNA. Essas mutações ocorrem em loci específicos em cerca de 60% de todos os tumores e, pelo menos no câncer colorretal, na verdade prolongam a vida do paciente em aproximadamente nove anos em comparação com o wtDNA. Mais de 70% dos cânceres colorretais têm pelo menos um mtDNA que é encontrado em níveis de heteroplasmia superiores a 5%.
Embora as nucleases possam eliminar mutações deletérias selecionando as mitocôndrias certas, uma tecnologia que pode editar novas variantes, por assim dizer, é algo ainda sendo aperfeiçoado. Embora os métodos de edição do CRISPR descritos nos artigos acima pareçam promissores, Payam relacionou três questões principais que fazem com que suas velas não percam um pouco o vento.
O primeiro ponto é que o artigo de Ciências da Vida não aborda totalmente a questão de direcionar o sgRNA para as mitocôndrias. Em segundo lugar, uma religação de quebra de fita dupla de nível muito baixo foi previamente descrita em mitos de mamíferos. A proteína Cas9 expressa em níveis elevados sem gRNA resulta na indução de fita dupla inespecífica. E em terceiro lugar, o inibidor de reparo DSB que os pesquisadores usaram pode não fazer o que se pensava tradicionalmente. Em outras palavras, embora se acreditasse que inibia a PARP (poli (ADP-ribose) polimerase), mais tarde foi demonstrado que operava em diferentes vias. Além disso, PARP nem mesmo está localizado nas mitocôndrias.
Uma nova abordagem interessante para a edição mitocondrial precisa e não destrutiva que não requer técnicas CRISPR foi descoberta recentemente por David Liu de Harvard e do Broad Institute do MIT. Você pode não reconhecer seu nome, embora ele tenha sido frequentemente citado como o verdadeiro inventor do CRISPR, porque os poderes superiores do moderno e progressista Comitê do Nobel consideraram que ele não se encaixava no projeto. O método de Liu se baseia em uma toxina bacteriana, DddA, que catalisa a desaminação de citosinas no DNA de fita dupla. Ao adicionar um inibidor de uracil glicosilase e proteínas semelhantes a TALEN, Liu criou editores de base de citosina derivada de DddA livre de RNA (DdCBEs) que podem catalisar conversões C – G-para-T – A em mtDNA humano com alta especificidade de alvo e pureza de produto .
Para explorar ainda mais o potencial de DdCBEs, o grupo de Liu editou com sucesso cinco genes mitocondriais: MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 e MT-ATP8. Qualquer pessoa que gostaria de ter uma mão em algumas dessas tecnologias pode acessar os plasmídeos que Liu carregou para Addgene. Por exemplo, há um construto ND4 no local denominado ND4-DdCBE-lado direito TALE, que tem uma estrutura pCMV e é expresso em células de mamíferos. Enquanto a edição mitocondrial completa de pares de bases específicos é muito superior a simplesmente clivar o mtDNA, a generalidade total da abordagem ainda precisa ser vista. A correção de mutantes só será viável se as falhas estiverem nas conversões específicas que o editor pode realizar.
Ter esse tipo de tecnologia disponível levanta a questão de saber se novas e benéficas formas de heteroplasmia mitocondrial persistente podem ser criadas. Por exemplo, pode ser possível introduzir ou criar mitocôndrias somaticamente heteroplasmáticas que são mais bem adaptadas a níveis de oxigênio de alta altitude ou que têm termogênese aprimorada. Em qualquer caso, seria improvável que essas manipulações pudessem ser herdadas; se não, eles não podem encontrar seu caminho para as células germinativas. Deixando de lado os defensores do embrião de três pais, introduzir artificialmente ou de outra forma modificar as mitocôndrias dentro do ovo seria o último (e mais perigoso) lugar onde alguém deveria começar a limpar clinicamente.
Um curioso vertebrado conhecido como Tuatara foi encontrado recentemente para manter duas linhagens independentes de mitocôndrias, apesar da divergência de sequência de cerca de 10%. Isso é totalmente inédito no reino animal, exceto por alguns moluscos bivalves que são conhecidos por terem herança biparental de mitocôndrias masculinas e femininas distintas. As principais diferenças foram relatadas para regiões de controle e origens de replicação no mtDNA Tuataran. Os pesquisadores sugerem que ter dois genomas mt divergentes pode conferir uma vantagem adaptativa para um réptil incomumente tolerante ao frio.
Em humanos, há necessidade abundante de edição mitocondrial para várias doenças neurológicas e raras. Por exemplo, o autismo foi associado a uma mutação do RNA de transferência (Lys) G8363A. Outros estudos demonstraram recentemente uma deficiência mitocondrial envolvendo uma mutação do gene ND6 missense (ND6P25L) que resulta em camundongos com endofenótipos decididamente autistas. ND6 é uma subunidade da NADH desidrogenase que faz parte do complexo respiratório I. Embora o autismo seja notoriamente repleto de inconsistências na tentativa de identificar genes causadores de estudos nucleares de GWAS, a edição mitocondrial em modelos animais pode ser uma maneira mais direta de definir melhor em última análise, cura muitas dessas doenças que têm um componente mitocondrial subjacente significativo.
Publicado em 06/02/2021 19h03
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