doi.org/10.1038/s41587-023-02085-z
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#CRISPR
‘Veículos de entrega envelopados’ direcionados a anticorpos editam seletivamente células T para criar células T CAR.
A maioria das terapias genéticas aprovadas atualmente, incluindo aquelas que envolvem CRISPR-Cas9, fazem sua mágica nas células removidas do corpo, após o que as células editadas são devolvidas ao paciente.
Esta técnica é ideal para atingir células sanguíneas e é atualmente o método empregado nas terapias genéticas CRISPR recentemente aprovadas para doenças do sangue como a anemia falciforme, nas quais as células sanguíneas editadas são reinfundidas em pacientes após a medula óssea ter sido destruída pela quimioterapia.
Avanço na entrega CRISPR-Cas9
Um novo método de entrega preciso para CRISPR-Cas9, publicado em 11 de janeiro na revista Nature Biotechnology, permite a edição de genes em subconjuntos muito específicos de células enquanto ainda estão no corpo – um passo em direção a um método de entrega programável que eliminaria a necessidade para destruir a medula óssea e o sistema imunológico dos pacientes antes de lhes dar células sanguíneas editadas.
O método de entrega, desenvolvido na Universidade da Califórnia, Berkeley, no laboratório de Jennifer Doudna, co-inventora da edição do genoma CRISPR-Cas9, envolve envolver as proteínas de edição Cas9 e os RNAs-guia em uma bolha de membrana que foi decorada com pedaços de anticorpos monoclonais. que se concentram em tipos específicos de células sanguíneas.
Explorando envelopes virais envelopados
Como demonstração, Jennifer Hamilton, pesquisadora CRISPR no laboratório Doudna do Innovative Genomics Institute (IGI), mirou uma célula do sistema imunológico – uma célula T – que é o ponto de partida para um tratamento revolucionário contra o câncer chamado receptor de antígeno quimérico. (CAR) Terapia com células T. Hamilton e seus colegas trataram camundongos vivos que haviam sido equipados com um sistema imunológico humanizado e transformaram suas células T humanas em células T CAR capazes de se localizar e eliminar outra classe de células imunológicas, as células B.
O feito foi uma prova de princípio, disse Hamilton, mostrando o potencial de utilização deste método de transporte – veículos de entrega envelopados – para atingir e editar células sanguíneas e potencialmente outros tipos de células em animais vivos (in vivo) e, eventualmente, em humanos.
“Nossa abordagem envolve multiplexar moléculas de direcionamento, isto é, ter duas ou mais moléculas de direcionamento em nossas partículas que interagem com sua célula-alvo, de forma semelhante a uma porta AND em um computador”, disse Hamilton, referindo-se a circuitos lógicos que operam apenas quando dois eventos acontecem. simultaneamente. “Conseguimos obter uma entrega mais eficaz quando as partículas se ligaram usando duas interações ligantes de anticorpos. Depois de tratar camundongos com vetores direcionados às células T, observamos a engenharia do genoma em nosso tipo de célula de interesse, as células T, e não nos hepatócitos do fígado.”
O direcionamento altamente específico é difícil para todos os métodos de entrega de genes nas células, disse ela. As células do fígado, em particular, muitas vezes utilizam veículos de distribuição direcionados para outros lugares.
Hamilton e sua equipe estão investigando uma das várias técnicas experimentais para aplicação de terapias genéticas. Muitos empregam a camada externa de vírus encapsulados – os vírus são esvaziados e preenchidos com transgenes corretivos ou ferramentas de edição de genes, como CRISPR-Cas9. Outros métodos, incluindo um que está sendo explorado por pesquisadores do IGI, dependem da injeção direta de proteínas Cas9 que penetram nas células em camundongos para conseguir a edição do genoma.
Hamilton, que estudou vírus envelopados como o da gripe para seu doutorado, concentrou-se na engenharia dessa classe de vírus porque eles têm uma camada externa mais flexível, que consiste na membrana externa da célula da qual brotaram.
Em uma publicação de 2021, ela demonstrou que o envelope externo de um vírus HIV-1, que foi eviscerado e preenchido com Cas9 e ela chamou de partícula semelhante a vírus (VLP), poderia editar células T em cultura (ex vivo) e convertê-los em células T CAR. Desde então, ela alterou tanto o envelope viral que agora se refere a eles como veículos de entrega envelopados, ou EDVs.
Um aspecto chave dos EDVs é que os seus envelopes externos podem ser facilmente decorados com mais de um fragmento de anticorpo ou ligante de direcionamento, o que melhora muito a especificidade do direcionamento. Outros veículos de entrega de genes, como vírus adeno-associados e nanopartículas lipídicas, têm se mostrado mais difíceis de atingir com precisão.
“Há esforços para redirecionar todos esses vetores para ter especificidade para um tipo de célula e desviá-los contra a entrega a outros tipos de células”, disse Hamilton. “Você pode exibir anticorpos ou fragmentos de anticorpos, como temos feito, mas a absorção nas células espectadoras ainda é bastante alta. Você pode influenciar a entrega em um tipo de célula, mas ainda poderá observar a captação em células espectadoras. Em nosso artigo, olhamos o fígado para ver se estávamos recebendo entrega fora do alvo e não vimos nada. Acho que seria mais desafiador conseguir isso com um vetor viral não envelopado ou nanopartícula lipídica mais tradicional.”
Terapia com células T CRISPR CAR in vivo
No artigo, Hamilton e seus colegas procuraram replicar in vivo uma terapia ex vivo com células T CRISPR CAR administrada com sucesso a pacientes com câncer que foi relatada na Science em 2020. Essa terapia não apenas forneceu um transgene para um receptor direcionado às células cancerígenas, mas derrubou, usando CRISPR, receptores que não tinham como alvo o câncer.
Os pesquisadores da UC Berkeley conseguiram eliminar o receptor nativo de células T e entregar um transgene para um receptor que tinha como alvo as células B – um substituto para as células cancerígenas. Como a proteína Cas9 foi entregue junto com o transgene dentro do mesmo EDV, ela teve uma vida útil mais curta do que os métodos que entregam um gene Cas9, o que se traduz em menos edições fora do alvo.
“O que tentamos alcançar neste artigo”, disse Hamilton, “foi pular toda aquela etapa de engenharia de células fora do corpo. Nosso objetivo era administrar sistemicamente um único vetor que faria tanto a entrega quanto a eliminação de genes em tipos específicos de células dentro do corpo. Usamos essa estratégia de entrega para produzir células T CAR editadas por genes in vivo, na esperança de podermos agilizar o processo complexo usado para fabricar células T CAR editadas por genes ex vivo.”
Direções Futuras e Acessibilidade
Doudna e seu laboratório continuam a melhorar a eficiência da entrega mediada por EDV. Hamilton, ex-pesquisadora de pós-doutorado no laboratório de Doudna, está desenvolvendo ainda mais esse método de entrega como bolsista do programa Women in Enterprising Science do IGI. A principal razão do laboratório para se concentrar em vetores que funcionam in vivo é tornar as terapias CRISPR mais amplamente disponíveis e mais baratas. Num ensaio recente publicado na revista Wired, Doudna referiu-se às desigualdades das dispendiosas terapias genéticas atuais, em parte devido às estadias hospitalares prolongadas que são necessárias quando um paciente é submetido a um transplante de medula óssea.
“A terapia para a doença falciforme está projetada para custar mais de US$ 2 milhões por paciente, e apenas um pequeno número de instalações nos EUA tem capacidade tecnológica para fornecê-la”, escreveu Doudna, que compartilhou o Prêmio Nobel de Química de 2020 por seu colega. -invenção da edição do genoma CRISPR-Cas9. “Novas tecnologias que permitam a entrega in vivo de terapias de edição genética e uma melhor produção serão fundamentais para reduzir os preços, assim como parcerias únicas entre universidades, governo e indústria, reunidas com a acessibilidade como um objetivo comum. Não basta simplesmente fabricar as ferramentas. Devemos garantir que eles cheguem àqueles que mais precisam deles.”
Publicado em 25/02/2024 00h00
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