Pesquisadores do Dana-Farber Cancer Institute e do St. Jude Children’s Research Hospital descobriram que o uso de CRISPR-Cas9 para gerar quebras de fita dupla (DSBs) no DNA para editar um gene pode levar ao processo mutacional de cromotripsia, que pode levar a doenças congênitas humanas e câncer.
Em um estudo publicado na segunda-feira na Nature Genetics, os pesquisadores disseram que experimentaram com células modelo, sequenciamento do genoma inteiro de célula única e edição em células clinicamente relevantes para demonstrar que a edição CRISPR-Cas9 gerou defeitos estruturais do núcleo, micronúcleos e pontes cromossômicas, iniciando, assim, extensos rearranjos cromossômicos ou cromotripsia. Na verdade, eles descobriram que a edição do genoma com Cas9 em células em divisão ativa causou um aumento de cerca de vinte vezes na formação de micronúcleos e / ou pontes cromossômicas.
Seus dados sugerem que a cromotripsia é uma consequência no alvo anteriormente não apreciada de DSBs gerados por CRISPR-Cas9 e que o potencial para rearranjos cromossômicos extensos deve ser considerado e monitorado como o CRISPR é terapeuticamente aplicado na clínica, disseram os pesquisadores. Eles observaram ainda que, embora a cromotripsia esteja implicada na tumorigênese, o potencial carcinogênico da cromotripsia induzida por CRISPR-Cas9 provavelmente dependeria do conjunto de genes do cromossomo alvo e se os rearranjos ocorrendo após o corte inicial causaram a exclusão desses genes ou amplificado.
O Cas9 gera um DSB que divide o cromossomo-alvo em dois segmentos, de acordo com os pesquisadores – um com a região do centrômero chamada de fragmento cêntrico e outro sem ela chamada de fragmento acêntrico. Se o DSB não for reparado antes da divisão celular, o fragmento acêntrico sem um centrômero funcional pode formar um micronúcleo. Eles avaliaram esse processo em células epiteliais de pigmento da retina humana geneticamente estáveis usando RNAs de guia único direcionados a sítios genômicos únicos em quatro cromossomos diferentes.
Eles descobriram que o corte CRISPR-Cas9 em locais alvo individuais induziu micronucleação em frequências de 4 por cento a 7,5 por cento, ou 10,2 vezes a 19,3 vezes, maior do que nos controles. Usando a hibridização in situ fluorescente (FISH), eles estabeleceram que 81 a 92 por cento da micronucleação continha o braço cromossômico direcionado pelas espécies específicas de gRNA. A maioria dos micronúcleos continha duas cópias do segmento de cromossomo alvo. Outras sondas FISH confirmaram que as micronucleações eram principalmente fragmentos cromossômicos acêntricos.
Em um experimento sobre edição de genoma específico de alelo, os pesquisadores usaram gRNAs que visavam apenas um alelo devido a um polimorfismo heterozigoto no motivo adjacente do protoespaçador (PAM). Eles detectaram eventos de edição exclusivamente no homólogo-alvo, e esses eventos de edição foram associados a um aumento de 2,7 e doze vezes na frequência de micronucleação para espécies de gRNA direcionadas a chr1p e chr5q, respectivamente. Além disso, eles observaram que gRNAs específicos de alelo geraram micronucleação principalmente com duas cópias do cromossomo direcionado, o que significa que guias específicos de alelo não eliminaram a formação de micronúcleos induzida por edição de genoma em células em divisão ativa.
Para testar diretamente se a cromotripsia pode ser uma consequência não reconhecida e no alvo da edição do genoma CRISPR-Cas9, os pesquisadores usaram um processo que chamaram de Look-Seq, que combinava imagens de células vivas de longo prazo com sequenciamento de genoma de célula única das células com imagens. Eles descobriram que a edição do genoma Cas9 no alvo gerava micronúcleos, que, por sua vez, induziam alterações no número de cópias do DNA no nível do braço do cromossomo, bem como perda de heterozigosidade neutra para o número de cópias.
Os pesquisadores notaram que a transformação maligna ou expansão celular clonal anormal após a edição do genoma não foi observada até agora em estudos animais, incluindo modelos de primatas não humanos, nem foi demonstrada no pequeno número de humanos que participaram de ensaios clínicos. Portanto, os riscos clínicos associados a terapias de edição de genoma baseadas em nuclease em participantes humanos permanecem obscuros, e as taxas de formação de micronúcleos ou pontes cromossômicas seguidas por cromotripsia ainda são desconhecidas para qualquer aplicação terapêutica de CRISPR.
No entanto, acrescentaram os autores, esses resultados têm várias implicações práticas. Em primeiro lugar, porque o reparo dirigido por homologia mediado por Cas9 eficiente requer que as células estejam se dividindo ativamente, a edição do genoma terapêutico por meio de união de extremidade não homóloga em células que não se dividem, como fotorreceptores retinais, não deve produzir micronúcleos. Além disso, eles disseram, a triagem para micronucleação e / ou cromotripsia em protocolos clínicos deve se tornar mais viável à medida que métodos de alto rendimento e baixo custo para o sequenciamento do genoma de uma única célula são desenvolvidos.
“Finalmente, nosso estudo motiva ainda mais o desenvolvimento de estratégias de edição de genoma que não geram quebras de DNA de fita dupla, o que, em princípio, deve minimizar o potencial de indução da cromotripsia”, escreveram os autores.
“Vários métodos mais novos, como a edição de base, agem por meio de mecanismos independentes de DSBs e, portanto, oferecem certas vantagens de segurança para reparar ou desligar genes”, disse Mitchell Weiss de St. Jude, co-autor do estudo, em um email. “No entanto, todo método de modificação genética carrega algum risco de genotoxicidade. Definir o risco versus benefício de diferentes estratégias de modificação de genes usadas para tratar diferentes doenças genéticas requer uma extensa pesquisa laboratorial e clínica.”
Publicado em 16/04/2021 10h45
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