Ninguém precisa lembrar Jennifer Doudna sobre o poder do CRISPR, a tecnologia de edição de genoma de precisão que ela co-desenvolveu. CRISPR “nos dá uma maneira de controlar a evolução de qualquer organismo – incluindo nós mesmos. É algo profundo. Os seres humanos agora aprenderam o suficiente sobre o nosso próprio código genético que podemos alterá-lo à vontade”, disse ela. “É meio louco pensar nisso.”
É por isso que quando surgiram relatórios em novembro passado de que o cientista He Jiankui, da Southern University of Science and Technology em Shenzhen, China, havia usado o CRISPR para alterar o DNA de meninas gêmeas – cruzando uma linha que os engenheiros genéticos respeitaram por décadas e reafirmaram em 2015 – Doudna foi rápido em falar. Descrevendo-se para a mídia como “horrorizada e atordoada”, ela criticou suas ações como arriscadas, prematuras e desnecessárias, dada a ausência da necessidade médica premente de que as crianças fossem modificadas experimentalmente. Ela encorajou a comunidade científica internacional a desenvolver melhores diretrizes para a edição permitida do genoma em humanos.
A tecnologia CRISPR torna a edição do genoma tentadoramente simples porque permite aos cientistas cortar e editar sequências de DNA em qualquer espécie, incluindo humanos, à vontade. Foi inspirado por um mecanismo de defesa há muito esquecido, com o qual muitas bactérias se defendem dos vírus: Ao inserir fragmentos de DNA viral em estruturas especializadas em seu próprio genoma (as “repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas” que dão ao CRISPR seu nome), as bactérias fornecem suas células filhas com uma maneira de reconhecer e rapidamente rejeitar futuras invasões de vírus semelhantes. Doudna e Emmanuelle Charpentier, do Instituto Max Planck de Biologia de Infecções, em Berlim, mostraram em 2012 que o sistema bacteriano poderia ser adaptado como ferramenta de edição. (Vários outros cientistas, incluindo Feng Zhang do Broad Institute e Virginijus Siksnys da Universidade de Vilnius também são creditados por contribuírem para o desenvolvimento do CRISPR, e vários processos de patentes cercam a propriedade da propriedade intelectual.)
Mas embora Doudna peça cautela ao contemplar as mudanças que podem ser passadas de geração a geração, ela continua uma forte defensora do potencial do CRISPR na pesquisa básica, bem como em suas aplicações médicas e de biotecnologia. “Eu acho que quando você entende como as coisas funcionam, você pode aplicá-las de forma mais eficaz. E depois de aplicá-los, você invariavelmente descobre coisas que não entendia sobre a biologia fundamental desse sistema”, disse Doudna. “Adoro esse tipo de interação.”
A Quanta Magazine conversou com Doudna, professor de química e biologia molecular e celular da Universidade da Califórnia, Berkeley, para discutir como o CRISPR está promovendo a pesquisa em biologia básica. Essa entrevista e as trocas subsequentes foram condensadas e editadas para maior clareza.
Quando o CRISPR é discutido em público, geralmente é em relação a como ele será usado para curar e tratar doenças. Como você acha que o CRISPR promoveu e continuará a pesquisa em biologia básica?
Vou dar dois exemplos que acho divertidos porque ilustram algumas das coisas criativas que as pessoas estão fazendo agora e que não eram possíveis no passado. Um deles é um projeto para investigar as origens do bipedalismo. Este projeto envolve a comparação da genética de dois tipos de roedores – um camundongo quadrúpede padrão e um roedor chamado jerboa que pula nas patas traseiras, então é bípede.
E se eu começar a colocar genes do roedor bípede no outro roedor? Posso eventualmente fazer um mouse de campo bípede? Este é o tipo de projeto que agora é possível com o CRISPR.
O outro experimento CRISPR que desejo destacar explora o conteúdo do genoma do Neandertal. Muitos de nós agora sabemos que temos um pouco de DNA de Neandertal em nosso background, mas quais eram as diferenças reais entre os humanos modernos e os Neandertais? Por que os neandertais foram extintos e o que isso pode nos dizer sobre nossa própria evolução?
Como você explora isso?
Um experimento que está em andamento está pegando genes do genoma do Neandertal e os colocando em células humanas que são cultivadas em laboratório na forma de organóides cerebrais. Organoides são bolas de tecido que formam estruturas semelhantes a órgãos em uma placa de laboratório. Não quero dizer que são como pequenos cérebros, mas esses organoides têm algumas propriedades de coleções de neurônios encontrados no cérebro.
A questão então é perguntar, se você começar a introduzir genes específicos de Neandertal nesses organóides do cérebro humano, o que acontece? Que tipo de mudanças vemos fisiologicamente nessas células e nessas bolas de tecido? Podemos aprender algo sobre a genética do desenvolvimento neuronal em neandertais que pode ser diferente do que acontece em humanos?
Estamos no início desta pesquisa, e um organoide não é a mesma coisa que um cérebro, então deve haver algumas interpretações do que os dados significam, mas acho que esse é o tipo de experimento que não poderia ter sido feito antes.
Por que não?
Na maior parte, não tínhamos uma maneira de introduzir mudanças nos genomas com precisão. A forma como a terapia gênica era feita originalmente era usando vírus que se integram ao DNA humano, mas os vírus se integram onde querem ir, não necessariamente onde você deseja fazer uma mudança no DNA.
As tecnologias anteriores para edição de genes também eram muito difíceis de usar em muitos ambientes. Eles exigiram muito trabalho braçal para se desenvolver, como a engenharia de proteínas específicas para cada alteração desejada em um genoma. Certamente, era difícil com essas tecnologias fazer mais de uma alteração por vez. Com o CRISPR, os experimentadores podem alterar vários genes em um genoma de uma só vez.
Você acha que as aplicações médicas do CRISPR por si mesmas podem informar a ciência básica?
Com certeza. A tecnologia CRISPR foi amplamente adotada por todos os tipos de cientistas, incluindo pessoas como eu. Eu nunca estava fazendo nada com edição de genoma antes do CRISPR aparecer.
Em meu laboratório, tivemos um projeto nos últimos anos trabalhando na coréia de Huntington, uma doença neurológica degenerativa. A mutação que causa a doença é um único códon – três pares de bases no DNA – que se repete várias vezes. Se o códon for repetido muitas vezes, isso levará a uma proteína defeituosa que causa a doença. Isso já se sabe há muito tempo, mas o desafio era: como corrigir isso?
Estamos trabalhando em uma maneira de entregar o CRISPR em células neuronais de camundongos para fazer as edições necessárias. Mas uma das coisas curiosas que resultaram dessa linha de trabalho é que descobrimos que apenas as células neuronais no cérebro do camundongo estavam sendo editadas, não as células [gliais de suporte] chamadas astrócitos.
Essas células são muito menores, então pode ser que não tenham área de superfície suficiente para absorver a proteína CRISPR de forma eficiente. Ou talvez eles não respondam ao corte e edição de DNA da mesma forma que outras células.
Portanto, nem todas as células do cérebro respondem ao tratamento CRISPR da mesma maneira.
Também descobrimos que, quando injetamos moléculas CRISPR em um local no cérebro do camundongo, vemos células que estão a uma distância razoável do local da injeção também são editadas. Isso foi uma surpresa porque sugere que há alguma maneira de trafegar moléculas através do cérebro para áreas que não estão bem ao lado de onde a agulha entra.
Existe algum mecanismo de tráfego molecular no cérebro que não foi avaliado? Essa é uma questão muito fundamental em biologia. Isso nos leva de volta à pergunta: “Puxa, como funciona o cérebro?” Agora estamos explorando as respostas para essas perguntas.
Devo dizer que este exemplo do meu laboratório é emblemático do que está acontecendo em uma variedade de laboratórios. O CRISPR permite experimentos muito aplicados, mas esses experimentos levantam questões fundamentais que você deve voltar e abordar.
Até que ponto você acha que o uso de CRISPR se tornará na biologia? Já parece estar em toda parte nos laboratórios biomédicos. Você acha que pode haver aplicações em campos como ecologia, por exemplo?
Absolutamente. Depende da sua definição de ecologia, mas alguns dos primeiros a adotar a tecnologia CRISPR eram pessoas que estavam tentando entender a genética do desenvolvimento de borboletas. Ter uma ferramenta que permite a manipulação de genes em organismos não-modelo – organismos que os cientistas não vêm trabalhando há décadas em laboratório, mas coletados na natureza – abre a possibilidade de experimentação real de uma forma que antes não era possível.
Efetivamente, qualquer organismo se torna um organismo modelo – um sistema geneticamente tratável para fazer experimentos. Brincamos no laboratório que estamos transformando humanos em fermento: no passado, você tinha que fazer experimentos com fermento ou moscas da fruta e então inferir o que esses dados significavam sobre as células humanas. Você não poderia facilmente manipular células humanas geneticamente para entender a função genética. Agora, com o CRISPR, você pode.
O CRISPR foi descoberto pela primeira vez como um mecanismo de defesa que as bactérias usam contra os vírus. Você acha que outras novas ferramentas de pesquisa podem vir de outras descobertas sobre bactérias?
Eu suspeito que sim. Se você olhar para as tecnologias que surgiram nas últimas décadas – reação em cadeia da polimerase para amplificação do DNA, clonagem molecular – todas surgiram do estudo de como os micróbios lutam contra os vírus ou respondem a estímulos.
Também sabemos muito pouco sobre o mundo bacteriano agora. Há um grande número de organismos que nunca foram identificados por cientistas ou cultivados em laboratório, e eles certamente têm uma biologia interessante associada a seus estilos de vida. À medida que mais desses organismos são estudados e identificados, não tenho dúvidas de que encontraremos coisas que se prestarão a novas tecnologias.
Há algum enigma específico nas bactérias que você acha que pode levar a algum tipo de ferramenta de pesquisa?
Isso sempre é difícil de prever. Dito isso, vou dar um exemplo de um fenômeno interessante: a descoberta desta nova categoria de bactérias que são incrivelmente pequenas. É um novo filo de organismos – atualmente eles são chamados de bactérias candidatas à radiação de filos (CPR). Eles quase desafiam a noção do que é uma célula e do que é um vírus.
Muitos desses organismos provavelmente crescem simbioticamente com outros insetos, compartilhando moléculas importantes, talvez até mesmo os blocos de construção de DNA, RNA e proteínas. Mas como eles importam moléculas? Como eles controlam seu ambiente para que outros tipos de bactérias não cresçam demais e os expulsem?
Todas essas são perguntas sem resposta. Não entendemos nada sobre sua biologia fundamental em um sentido molecular. As respostas a essas perguntas levarão a uma nova tecnologia? Eu não sei, mas certamente vai levar a uma biologia interessante.
Portanto, o lugar para procurar novas ferramentas de pesquisa pode ser organismos atípicos, por assim dizer?
Mas como você define atípico? Tem uma velha canção de Steve Forbert: “Costuma-se dizer que a vida é estranha … mas comparada com o quê?”
Essas minúsculas bactérias RCP são aquelas em que você e Jillian Banfield, da Universidade da Califórnia, em Berkeley, descobriram recentemente novas enzimas Cas [para cortar fitas de DNA] que poderiam ser usadas com a tecnologia CRISPR, não são? O que torna essas enzimas Cas potencialmente tão interessantes e úteis?
Uma das novas enzimas que identificamos é chamada de ?CasX?. É particularmente interessante porque parece funcionar de forma bastante diferente de seu primo Cas9, a enzima que muitas bactérias convencionais usam em suas defesas CRISPR e que é comumente usada na tecnologia CRISPR. Mas alguns ingredientes básicos são os mesmos. Isso nos dá uma visão sobre a receita básica para proteínas de corte CRISPR. Quanto mais entendemos essas proteínas, melhor podemos projetá-las. CasX também é atraente porque é muito menor do que Cas9, o que pode tornar mais fácil deslizar para dentro das células para edição terapêutica do genoma.
Também houve outras novas tecnologias derivadas do CRISPR-Cas9, como CRISPR-GO, imagem de DNA e anti-CRISPR. Como eles podem ajudar a biologia básica?
Então, vamos ver isso. CRISPR-GO é essa maneira inteligente de usar enzimas CRISPR para trazer partes específicas do genoma para a proximidade física. Há evidências de que, quando os genes estão sendo expressos juntos nas células, muitas vezes eles são reunidos fisicamente no mesmo local nas células, e isso pode afetar fundamentalmente os níveis de proteínas que são produzidas a partir de certos genes. O que o CRISPR-GO faz é fornecer uma tecnologia para fazer esse tipo de tethering físico, exceto que agora os cientistas podem controlá-lo em vez de a célula controlá-lo. Acho que isso cria uma oportunidade para começar a dissecar a relação entre a arquitetura 3D do genoma e a comunicação entre os genes, e os níveis resultantes de proteínas ou moléculas de RNA que são feitas a partir desses genes. Isso é empolgante. É algo que, novamente, realmente não foi possível antes, controlar a arquitetura 3D dos cromossomos e perguntar como isso afeta a saída do genoma.
Você mencionou imagens de DNA. A ideia aí é o que está sendo referido como “pintura cromossômica”, onde você pode programar a proteína CRISPR-Cas9 para se ligar e basicamente sentar-se por longos períodos de tempo em certos lugares do DNA. Você pode decorar a proteína CRISPR-Cas9 com diferentes cores de corantes para iluminar um determinado gene ou seção de um genoma, até mesmo um cromossomo inteiro, simplesmente encadeando-o com esses pequenos complexos de RNA-proteína. Portanto, é um método de imagem.
No caso do anti-CRISPR, são proteínas naturais minúsculas envolvidas na regulação dos sistemas CRISPR. Você pode imaginar que, em bactérias que estão sendo infectadas por vírus, com o tempo, os vírus desenvolveram maneiras de evitar serem eliminados por CRISPRs, e uma das maneiras de fazer isso é usando esses pequenos inibidores chamados anti-CRISPRs. Há interesse nisso por causa do potencial de controlar os resultados da edição de genes – usando esses tipos de proteínas para desligar as proteínas de edição de genes em células para proteger o genoma de ser modificado de maneiras não intencionais. Há toda uma linha de pesquisa agora que foi lançada para examinar os reguladores e inibidores naturais das vias CRISPR e perguntar se eles podem ser aproveitados para fins tecnológicos.
O desenvolvimento do anti-CRISPR poderia acabar com os temores sobre a edição do genoma em humanos ou outros organismos, se tivéssemos um botão para desligar se o CRISPR-Cas9 não estivesse funcionando como pretendido?
É exatamente nisso que as pessoas estão pensando. Na verdade, há todo um programa financiado pela DARPA (a Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa dos EUA), que tem o título “Genes Seguros”, que trata de maneiras seguras de manipular genes e genomas. E uma das estratégias que os grupos estão usando para fazer isso é usar esses anti-CRISPRs.
Você acha que o CRISPR nos ajuda a entender como todas as peças nas células estão trabalhando juntas, em vez de apenas separadamente?
Acho que cada vez mais desempenhará esse tipo de papel no futuro.
Voltemos à neurociência, porque há um caso em que o CRISPR ganhou destaque nos estudos do desenvolvimento do cérebro. Os pesquisadores não conseguiram descobrir quantos tipos diferentes de células existem no cérebro. Também não sabemos como o cérebro se desenvolve no sentido de sua arquitetura 3D. Se você começa com uma célula-tronco ou algumas células-tronco, como isso se desenvolve em um cérebro inteiro, e qual é o mapa do cérebro?
Há muito interesse agora em usar o CRISPR para fazer o que é chamado de mapeamento de linhagem. Se você tem uma população de células que se desenvolve a partir de uma única célula ou de uma pequena coleção de células, pode rastrear como as células dessa população inicial dão origem à sua progênie, introduzindo uma pequena edição em seu DNA para marcá-las.
Várias equipes de pesquisa estão usando o CRISPR dessa forma para descobrir onde essas células-filhas vão parar no cérebro e até mesmo em que tipo de célula elas se tornam. Acho que esses tipos de experimentos levarão a uma compreensão mais fundamental do desenvolvimento do tecido – em particular, no cérebro – que não era possível antes.
Isso parece promissor.
Vou te dar outro exemplo. Existem casos interessantes – e estamos descobrindo mais e mais deles conforme as pessoas sequenciam seu DNA – de famílias em que todos têm um certo alelo, uma certa sequência de DNA de um gene, mas apenas alguns deles têm uma doença associada com esse alelo. Os outros não. Então, você sabe que há algo no DNA das pessoas que não são afetadas que suprime um impacto negativo desse gene e as torna não suscetíveis ao câncer ou qualquer outra doença à qual sucumbiriam de outra forma. Quais são esses supressores?
Acho que entender esses tipos de interações genéticas será incrivelmente poderoso daqui para frente. Até agora, não tínhamos realmente uma maneira de fazer isso porque, em primeiro lugar, as pessoas não estavam amplamente sequenciando seus genomas. Isso está começando acontecendo cada vez mais, com empresas que oferecem isso e os custos estão caindo. Então, há também uma tecnologia que permite a manipulação genética de células derivadas de pacientes. Então, se você tem alguém que vem a uma clínica e tem uma doença que é diagnosticada, você pode tirar células dessa pessoa e pode cultivá-las no laboratório. Isso tem sido possível por um tempo, mas o que não era possível anteriormente era fazer genética nessas células. Agora podemos, em células vivas que se relacionam com um paciente real.
Isso parece um benefício inesperado da tecnologia de sequenciamento.
Sempre gosto de salientar que existe uma certa sorte na ciência. É maravilhoso, mas também significa que você não pode prever resultados. A tecnologia CRISPR é um grande exemplo disso. Se você tivesse me dito há 10 anos que as bactérias desenvolveram proteínas que poderiam ser programadas para encontrar e cortar qualquer sequência de DNA, eu teria apenas rido. Eu teria pensado: “Sim, isso é definitivamente ficção científica.”
Acho que é importante que as pessoas percebam que é assim que acontece muita ciência.
Publicado em 19/09/2021 18h04
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