Os cientistas finalmente recriaram as etapas iniciais da infecção pelo HIV em um tubo de ensaio, oferecendo uma visão incrivelmente ampliada do vírus em ação.
As imagens surpreendentes mostram uma concha em forma de cone de ladrilhos geométricos, chamada de capsídeo, que fica no centro do vírus e contém seu material genético, conhecido como RNA. Antes de se infiltrar em uma célula, o capsídeo é circundado por um envelope de moléculas de gordura; este envelope se funde com a célula hospedeira para deixar o capsídeo entrar, onde então carrega o RNA para o núcleo da célula. No caminho, o RNA se replica e, uma vez dentro do núcleo, invade o DNA do hospedeiro.
Ao conceder um olhar mais atento a esse processo de replicação, o novo estudo destaca que o próprio capsídeo desempenha um papel crítico na infecção e que critérios específicos devem ser atendidos para que o vírus entrelaça seu genoma com o da célula hospedeira.
Saber como recriar as etapas iniciais da infecção pelo HIV “significa que temos muito mais ferramentas para dissecar o processo de replicação”, disse o autor do estudo Wesley Sundquist, um distinto professor de bioquímica da University of Utah Health. Em particular, o estudo, publicado em 8 de outubro na revista Science, descreve um sistema livre de células que pode ser usado para estudar como o HIV invade o genoma do hospedeiro – tal sistema poderia “revolucionar os experimentos de HIV em muitos laboratórios”, Leo James, um líder de grupo no Laboratório MRC de Biologia Molecular, que não estava envolvido no estudo, disse ao Live Science por e-mail.
“Ter realizado tudo isso é um verdadeiro tour de force”, disse James. Além da pesquisa básica, o sistema também pode ajudar a explicar como drogas experimentais que visam o capsídeo funcionam para limitar a replicação do HIV, disse Sundquist em um comunicado.
Ensaios de tubo de ensaio
Embora os experimentos em tubo de ensaio capturem aspectos da infecção por HIV em detalhes excelentes, eles não podem recriar todas as etapas do processo, observou Sundquist. A infecção geralmente começa quando a membrana externa do vírus se funde com a membrana de uma célula hospedeira, permitindo que o capsídeo e suas entranhas entrem sorrateiramente. Mas com um sistema livre de células, os autores tiveram que pular essa etapa inicial.
Em vez disso, eles usaram um composto encontrado no veneno de abelha, chamado melitina, para “permeabilizar” a membrana viral e liberar o capsídeo contido nela.
O capsídeo do HIV tem minúsculos poros e, normalmente, à medida que uma partícula de vírus flutua no citoplasma de uma célula humana, ele pega os blocos de construção celulares do DNA, chamados de trifosfatos desoxinucleotídeos, que já estão lá, de acordo com um relatório de 2017 publicado no jornal Nature. À medida que viaja para o núcleo, a partícula do vírus usa esses blocos de construção para fazer cópias de fitas completas de DNA, graças a uma enzima especial alojada dentro do capsídeo. É assim que o vírus copia seu material genético para posteriormente se inserir no genoma do hospedeiro. Como o vírus “sabe” quando iniciar essa assim chamada transcrição reversa ainda é um tanto misterioso, mas estudos sugerem que as propriedades bioquímicas da célula hospedeira atuam como pistas para o início da reação.
Mas um tubo de ensaio não tem blocos de construção de DNA automaticamente em solução, então, para iniciar a transcrição reversa, os autores os adicionaram. “Este método já existe há algum tempo, mas é difícil fazer a reação ir até a conclusão”, observou James. Mas os autores do estudo conseguiram fazer a transcrição reversa funcionar sem problemas; para fazer isso, eles aprenderam que o capsídeo deve permanecer praticamente intacto durante todo o processo.
“O capsídeo deve estar totalmente intacto e ter a estabilidade ou flexibilidade adequadas para suportar a transcrição reversa”, o que significa que o capsídeo deve ser ligado com firmeza o suficiente para não se desfazer durante a transcrição reversa, mas capaz de se abrir quando o O capsídeo entra no núcleo, a fim de liberar seu DNA copiado, disse Sundquist. Felizmente, os cientistas descobriram recentemente uma maneira de manter o capsídeo estável o suficiente.
O autor do estudo, Owen Pornillos, professor associado de fisiologia molecular e física biológica da Universidade da Virgínia, e seus colegas descobriram que um composto chamado IP6 se liga à superfície de azulejos do capsídeo, relataram eles em 2018 na revista Nature. IP6 carrega uma carga negativa, enquanto cada bloco carrega uma carga positiva no lado que aponta em direção ao centro do capsídeo; uma vez que os opostos se atraem, quando o IP6 se liga ao capsídeo, ele ajuda a puxar os ladrilhos para um arranjo mais firme e estável.
“Antes da descoberta do IP6, alguém removia o envelope [viral] in vitro e tudo se desmanchava e eles não podiam ver nada”, disse João Mamede, professor assistente do Departamento de Patógenos Microbianos e Imunidade da Universidade Rush, que não esteve envolvido no estudo.
O IP6 é “bastante abundante” nas células, então, em seus experimentos em tubos de ensaio, os autores adicionaram concentrações semelhantes do composto que seriam encontradas nas células, disse Sundquist. “Esse foi realmente o truque”, acrescentou. “Até que soubéssemos, estávamos trabalhando com cápsides muito instáveis.”
Ver é crer
Usando modelos de moléculas de computador e um microscópio eletrônico, os autores puderam literalmente ver que os 240 blocos que compõem o capsídeo mantinham sua estrutura semelhante a uma rede estável durante a transcrição reversa. À medida que os filamentos de DNA cresciam, suas extremidades às vezes apareciam por minúsculas lacunas na trama, observaram os autores, e às vezes telhas singulares podiam ser vistas se deslocando enquanto o resto do capsídeo permanecia intacto.
O capsídeo pode precisar ficar estável para manter o RNA e a enzima de transcrição próximos um do outro, disse Christopher Aiken, professor de patologia, microbiologia e imunologia da Universidade de Vanderbilt, que não esteve envolvido no estudo. A enzima tende a cair do RNA durante a transcrição, então “ao manter a enzima contida, ela pode religar o molde e continuar a síntese de DNA”, disse Aiken à Live Science por e-mail.
Com a transcrição reversa concluída, os autores passaram para a próxima etapa da infecção: integração, onde o DNA viral se infiltra no genoma do hospedeiro. Eles introduziram fitas de DNA conhecidas como plasmídeos em seus tubos de ensaio, para servir como representantes do DNA em um núcleo humano, mas a integração não começaria sem um ingrediente adicional. Apenas “extratos de células inteiras”, uma mistura de proteínas e moléculas extraídas das células, permitiriam que o DNA viral invadisse os plasmídeos.
No futuro, a equipe espera determinar com precisão quais ingredientes nos extratos de células desencadeiam a integração, disse Sundquist. “É provável que seja mais de uma coisa”, observou ele. Um desafio é que, em experimentos com tubos de ensaio, “é sempre difícil saber se está faltando alguma coisa”, disse ele.
Uma limitação do estudo é que ele não pode recriar perfeitamente as condições celulares, disse James.
“Qualquer sistema in vitro, por mais poderoso que seja, só pode ser usado para testar os componentes que conhecemos e adicionar à reação”, disse James. Por exemplo, em células reais, o capsídeo deve viajar para o núcleo da célula, onde o DNA é mantido, e então deslizar através de portais conhecidos como poros nucleares. Pode haver fatores desconhecidos que alteram o capsídeo durante esta viagem, observou Sundquist.
Dito isso, o novo sistema livre de células pode ajudar a revelar a identidade desses fatores desconhecidos, acrescentou Mamede. Os cientistas agora podem fazer observações em um ambiente livre de células e, em seguida, verificar se o mesmo comportamento aparece nas células reais, disse ele.
Além disso, o sistema pode ser útil no desenvolvimento de medicamentos. “Você pode testar [novos medicamentos] mais facilmente com um desses sistemas simplificados do que com uma célula”, disse Mamede ao Live Science. “Dessa forma, você pode ver mecanicamente o que ele realmente está fazendo com o vírus.”
A empresa farmacêutica Gilead Sciences tem atualmente um novo medicamento em testes em humanos que tem como alvo específico o capsídeo do HIV, de acordo com ClinicalTrials.gov. Com base em dados anteriores, a droga parece alterar o capsídeo em vários pontos de infecção, incluindo durante a transcrição reversa. Sundquist disse que o estudo sem células destaca que o capsídeo é um “componente crítico” da infecção pelo HIV, e que corromper o capsídeo pode limitar a capacidade do vírus de se multiplicar.
Publicado em 09/10/2020 13h26
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