Um dos grandes desafios com o uso de edição genética baseada em CRISPR em humanos é que a maquinaria molecular às vezes faz alterações na seção errada do genoma de um hospedeiro, criando a possibilidade de que uma tentativa de reparar uma mutação genética em um ponto do genoma possa acidentalmente criar uma nova mutação perigosa em outra.
Mas agora, cientistas da Universidade do Texas em Austin redesenharam um componente-chave de uma ferramenta de edição de genes baseada em CRISPR amplamente usada, chamada Cas9, para ter milhares de vezes menos probabilidade de atingir o trecho errado de DNA, mantendo a mesma eficiência. como a versão original, tornando-a potencialmente muito mais segura. O trabalho é descrito em um artigo publicado hoje na revista Nature.
“Isso realmente pode ser um divisor de águas em termos de uma aplicação mais ampla dos sistemas CRISPR Cas na edição de genes”, disse Kenneth Johnson, professor de biociências moleculares e coautor sênior do estudo com David Taylor, professor assistente de biologia molecular. biociências. Os co-primeiros autores do artigo são os pós-doutorandos Jack Bravo e Mu-Sen Liu.
Outros laboratórios redesenharam o Cas9 para reduzir as interações fora do alvo, mas até agora, todas essas versões melhoram a precisão ao sacrificar a velocidade. SuperFi-Cas9, como esta nova versão foi apelidada, é 4.000 vezes menos provável de cortar sites fora do alvo, mas tão rápido quanto o Cas9 natural. Bravo diz que você pode pensar nas diferentes versões do Cas9 geradas em laboratório como diferentes modelos de carros autônomos. A maioria dos modelos são realmente seguros, mas têm uma velocidade máxima de 10 milhas por hora.
“Eles são mais seguros do que o Cas9 natural, mas tem um grande custo: eles estão indo extremamente devagar”, disse Bravo. “O SuperFi-Cas9 é como um carro autônomo que foi projetado para ser extremamente seguro, mas ainda pode andar a toda velocidade.”
Até agora, os pesquisadores demonstraram o uso do SuperFi-Cas9 no DNA em tubos de ensaio. Eles agora estão colaborando com outros pesquisadores que planejam testar o SuperFi-Cas9 para edição de genes em células vivas. Eles também estão trabalhando para desenvolver versões ainda mais seguras e ativas do Cas9.
As ferramentas de edição de genes baseadas em CRISPR são adaptadas de sistemas de ocorrência natural em bactérias. Na natureza, uma proteína Cas9 flutua no ambiente, procurando por DNA com uma sequência muito específica de 20 letras, como o X em um mapa pirata que indica “cava aqui”. Às vezes, quando a maioria das letras está correta, exceto aquelas nos pontos 18 a 20, Cas9 ainda segue em frente e se aprofunda. Isso é chamado de incompatibilidade e pode ter consequências desastrosas na edição de genes.
Taylor e Johnson desenvolveram uma técnica chamada determinação de estrutura guiada por cinética que usou um microscópio crioeletrônico no Laboratório de Biologia Estrutural Sauer para tirar fotos do Cas9 em ação enquanto interagia com esse DNA incompatível.
Eles ficaram surpresos ao descobrir que quando o Cas9 encontra esse tipo de incompatibilidade nas posições 18 a 20, em vez de desistir e seguir em frente, ele tem uma estrutura semelhante a um dedo que mergulha e segura o DNA, fazendo com que ele aja como se estivesse foram a sequência correta. Normalmente, uma incompatibilidade deixa o DNA um pouco flexível; esta estrutura semelhante a um dedo o estabiliza.
“É como se você tivesse uma cadeira e uma das pernas fosse arrancada e você apenas colasse com fita adesiva novamente”, disse Bravo. “Ainda pode funcionar como uma cadeira, mas pode ser um pouco instável. É uma correção muito suja.”
Sem essa estabilidade adicional no DNA, o Cas9 não executa as outras etapas necessárias para cortar o DNA e fazer edições. Ninguém jamais havia observado esse dedo extra fazendo essa estabilização antes.
“Isso foi algo que eu nunca poderia, em um milhão de anos, imaginar que aconteceria”, disse Taylor.
Com base nessa percepção, eles redesenharam o dedo extra no Cas9 para que, em vez de estabilizar a parte do DNA que continha a incompatibilidade, o dedo fosse empurrado para longe do DNA, o que impede que o Cas9 continue o processo de corte e edição do DNA. O resultado é a SuperFi-Cas9, uma proteína que corta o alvo certo tão prontamente quanto a Cas9 natural, mas é muito menos provável que corte o alvo errado.
Outros autores são Grace Hibshman, Tyler Dangerfield, Kyungseok Jung e Ryan McCool, também da Universidade do Texas em Austin.
Bravo, Liu, Hibshman, Dangerfield, Johnson e Taylor são inventores de um pedido de patente que cobre novos projetos Cas9 baseados neste trabalho.
Publicado em 05/03/2022 20h03
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