A nossa Terra Rara, o mais raro dos planetas no Universo, até agora único dentre todos os planetas de todos as estrelas de todas as galáxias conhecidas…
Sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 usado para aprender mais sobre a evolução de vírus gigantes
CRISPR/Cas9 permite a manipulação de A. castellanii. a Construtos usados para expressar constitutivamente Cas9 em A. castellanii. A sequência do gRNA é representada com diamantes seguidos pelo andaime de ligação Cas9 e um A. castellanii tRNA (retângulos amarelos). A localização da fusão GFP-Cas9 para os diferentes construtos é mostrada por fluorescência. As micrografias são representativas de 3 experimentos independentes. Barra de escala: 10?m. b Micrografias representativas mostrando amebas expressando mRFP (vetor Vc241) e GFP-Cas9 após seleção por 2 a 3 semanas com o(s) medicamento(s) apropriado(s) (consulte materiais e métodos). A fluorescência de mRFP (produto do gene alvo) e GFP (indicando a expressão de Cas9) é mostrada. MCR: reação em cadeia mutagênica. Barra de escala: 10?m. c A quantificação da micrografia mostrada em (b). A média?±?DP de pelo menos 200 amebas (3 experimentos independentes (n?=?3)) é mostrada. As amebas foram classificadas como não fluorescentes, mRFP+, GFP+ ou GFP+mRFP+. MCR: reação em cadeia mutagênica. Guias direcionados ao pandoravirus rpb1 foram usados como gRNAs fora do alvo. Nd: não detectado. d Resultados de sequenciamento representativos de sequências guia direcionadas em rfp após a transfecção com gRNAs no alvo. A PCR foi realizada nas sequências alvo conforme mostrado na Fig. S1a, b, clonada em um vetor de clonagem TA e clones únicos foram enviados para sequenciamento. A sequência de tipo selvagem e as mutações geradas são mostradas em vermelho e azul, respectivamente. Dez clones individuais foram amplificados e sequenciados. e Representação esquemática do locus rfp, guia de localização de direcionamento, braços de homologia para recombinação e sítios de recozimento de primer para uma interrupção usando uma estratégia de “reação em cadeia mutagênica” (consulte a Fig. S1e). f Interrupção do gene de rfp pela “reação em cadeia mutagênica” observada no nível da população após 2-3 semanas após a transfecção. Tamanho esperado da PCR: a?+?b: 837?bp (locus não modificado), a?+?b 890?bp (locus recombinante), a?+?c: 500?bp (locus não modificado). Observe que o primer b recoze tanto no locus de tipo selvagem quanto no locus recombinante, resultando em produtos de PCR com pequenas diferenças de tamanho. Crédito: Nature Communications (2023). DOI: 10.1038/s41467-023-36145-4
Uma equipe de virologistas da Universidade de Aix-Marseille encontrou evidências que sugerem que o vírus gigante Pandoravirus neocaledonia evoluiu de vírus menores e mais simples. Em seu estudo, publicado na revista Nature Communications, o grupo usou uma versão modificada do sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 para aprender mais sobre a história evolutiva do vírus gigante e talvez de outros como ele.
Pesquisas anteriores mostraram que a maioria dos vírus são muito menores que as bactérias. Mas alguns são tão grandes que os biólogos se referem a eles como vírus gigantes. Um tanto perplexos com sua existência, os biólogos evolutivos há muito debatem como esses vírus estranhos podem ter surgido.
Atualmente, existem duas teorias principais: A primeira é que eles evoluíram como uma mistura de vários vírus menores. A segunda é que eles evoluíram de organismos maiores e mais sofisticados. Nesse novo esforço, a equipe na França adotou uma nova abordagem para resolver o mistério – usando CRISPR/Cas9 para identificar o que é conhecido como genes essenciais no genoma do vírus (aqueles necessários para a reprodução).
Pesquisas anteriores mostraram que uma boa maneira de descobrir genes essenciais é remover os genes um de cada vez até que o organismo não seja mais capaz de se reproduzir. É aí que entra o CRISPR/Cas9 – ele permite eliminar quaisquer genes desejados. Mas o Pandoravirus neocaledonia apresentou um problema – ele tem 25 cópias de cada um de seus cromossomos, e o CRISPR/Cas9 só é capaz de derrubar um gene por vez. Para superar esse problema, a equipe modificou o sistema de edição de genes para gerar uma reação em cadeia – sempre que um gene era cortado, outro corte era iniciado ao longo da cadeia até que todas as cópias fossem removidas.
Depois de executar sua edição genética de reação em cadeia no Pandoravirus neocaledonia até que o vírus não fosse mais capaz de se reproduzir, eles descobriram que os genes necessários para a reprodução estavam localizados em apenas uma extremidade do genoma, um pouco separados de outros genes menos essenciais – evidência, a equipe sugere que o vírus evoluiu de vários vírus menores. Eles sugerem que é provável que outros vírus gigantes tenham evoluído de maneira semelhante.
