Uma nova técnica de edição de genes do CRISPR impediu que uma doença genética do fígado fosse causada por centenas de mutações diferentes e melhorasse os sintomas clínicos em camundongos, relataram os pesquisadores da Penn Medicine em um novo estudo de prova de conceito publicado on-line na Science Advances.
Os resultados sugerem uma ferramenta CRISPR promissora que pode potencialmente tratar pacientes com um raro distúrbio metabólico do ciclo da ureia causado por uma deficiência da enzima ornitina transcarbamilase (OTC), além de outras doenças hereditárias desencadeadas por diferentes mutações no mesmo gene.
A abordagem CRISPR se baseia na anterior, desenvolvida na Penn Medicine, que se limitava a corrigir apenas uma mutação – beneficiava ratos recém-nascidos, mas não adultos. Desta vez, a técnica – que emprega um novo vírus adeno-associado duplo (AAV) para entregar seus componentes – inseriu um “minigene” no genoma para obter uma expressão sustentada de OTC nas células hepáticas, no que é conhecido como abordagem “recortar” e “colar”. Nenhuma mutação é corrigida, mas um novo conjunto de instruções é adicionado às células. Como resultado, os pesquisadores observaram um benefício clínico em ratos recém-nascidos que se mantiveram na idade adulta.
“Como a maioria das doenças genéticas que apresentam efeitos letais em recém-nascidos, tratamentos precoces eficazes a longo prazo são essenciais”, disse James Wilson, MD, Ph.D., professor de Medicina e diretor do Programa de Terapia Gênica e do Centro de Doenças Órfãs em Penn. “Aqui, avançamos uma abordagem CRISPR para não apenas sustentar a expressão do OTC nas células, mas também ampliar as habilidades da ferramenta. Nosso objetivo é, eventualmente, traduzir essa abordagem de edição de genes de animais para tratar pacientes com distúrbios do OTC e outras doenças genéticas causadas por mutações espalhadas por todo o gene – em vez de uma única mutação predominante “.
Encontrado em quase um em cada 40.000 nascimentos, o transtorno OTC pode resultar de mais de 300 mutações diferentes no gene OTC. Como essas mutações ocorrem no cromossomo X, normalmente é encontrada em homens, enquanto as mulheres são portadoras. O ciclo da uréia é uma série de seis enzimas hepáticas que ajudam a livrar o corpo da amônia. Quando uma dessas enzimas está ausente ou é deficiente, a amônia se acumula no sangue e viaja para o cérebro, o que pode causar danos cerebrais e até a morte. Para tratar a doença, os pacientes tomam medicamentos para estimular vias alternativas de liberação de nitrogênio ou, em casos graves, um transplante de fígado. No entanto, a mortalidade nesses pacientes ainda é alta, havendo necessidade de terapias mais novas e eficazes.
Para desenvolver uma ferramenta de edição de genoma amplamente aplicável, a equipe construiu um novo vetor duplo de AAV contendo uma proteína bacteriana guiada por RNA conhecida como Cas9 – um método rápido e confiável para encontrar e manipular genes nas células. Conhecido como AAV8, esse vetor desenvolvido pela Penn tem uma afinidade específica pelas células hepáticas. O segundo AAV continha um “minigene” em pleno funcionamento que expressa um OTC humano otimizado para códons – o DNA do doador – acionado por um promotor específico do fígado para garantir que ele só se expresse nas células hepáticas quando injetado no sangue.
O primeiro passo é a criação de uma quebra no DNA por Cas9 no local de direcionamento ao longo do gene (o “corte”), que prepara o cenário para a adição do minigene no que é denominado reparo direcionado à homologia, ou HDR (o “colar”).
“Ao contrário de outras abordagens do CRISPR que excluem ou modificam uma parte do gene normal, essa técnica integra uma nova porção”, disse o primeiro autor Lili Wang, Ph.D., professor associado de medicina. “Não estamos tentando corrigir mutações que impedem as células hepáticas de produzir OTC, estamos adicionando esse novo minigene para que as células possam”.
Os ratos tratados com o vetor alvo mostraram 25 e 35 por cento das células que expressam OTC no fígado em três e oito semanas, respectivamente – o que é quatro e três vezes maior do que os ratos tratados com o vetor não direcionado. Nos dois momentos (três e oito semanas), a maioria das células hepáticas positivas para OTC estavam localizadas em grupos espalhados por todas as partes do fígado nos ratos-alvo.
Os pesquisadores também observaram uma redução de 60% nos níveis de amônia nos ratos-alvo em comparação aos ratos não tratados, alimentados com uma dieta rica em proteínas, um sinal clínico que sugere que as células hepáticas estão produzindo OTC.
“Com esses estudos bem-sucedidos em animais, nos aproximamos de uma abordagem potencial de edição de genes de ‘amplo espectro’ para tratar pacientes com deficiência de OTC, independentemente de mutação e estado clínico”, afirmou Wilson. “O próximo passo, através de estudos pré-clínicos adicionais, é encontrar um local seguro para o gene nas células hepáticas humanas e, em seguida, testar uma abordagem semelhante de edição de genes”.
Publicado em 15/02/2020 15h13
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