A tecnologia CRISPR permite aos pesquisadores editar genomas, alterando as sequências de DNA e, assim, modificando a função do gene. Suas muitas aplicações potenciais incluem a correção de defeitos genéticos, o tratamento e a prevenção da propagação de doenças e a melhoria das safras.
Ferramentas de edição de genoma, como a tecnologia CRISPR-Cas9, podem ser projetadas para fazer alterações extremamente bem definidas no alvo pretendido em um cromossomo onde um determinado gene ou elemento funcional está localizado. No entanto, uma complicação potencial é que a edição CRISPR pode levar a outras alterações genômicas não intencionais. Isso é conhecido como atividade fora do alvo. Ao alvejar vários locais no genoma, a atividade fora do alvo pode levar a translocações, rearranjo incomum de cromossomos, bem como outras modificações genômicas não intencionais.
Controlar a atividade de edição fora do alvo é um dos desafios centrais para tornar a tecnologia CRISPR-Cas9 precisa e aplicável na prática médica. Os ensaios de medição atuais e os métodos de análise de dados para quantificar a atividade fora do alvo não fornecem avaliação estatística, não são suficientemente sensíveis para separar o sinal do ruído em experimentos com baixas taxas de edição e requerem esforços pesados para abordar a detecção de translocações.
Na edição de 24 de maio da revista Nature Communications, uma equipe multidisciplinar de pesquisadores do Centro Interdisciplinar de Herzliya e da Universidade Bar-Ilan relatou o desenvolvimento de uma nova ferramenta de software para detectar, avaliar e quantificar a atividade de edição fora do alvo, incluindo eventos adversos de translocação que pode causar câncer. O software é baseado na entrada obtida de um ensaio de medição padrão, envolvendo amplificação PCR multiplexada e Sequenciamento de Próxima Geração (NGS).
Conhecida como CRISPECTOR, a ferramenta analisa dados de sequenciamento de última geração obtidos de experimentos CRISPR-Cas9 e aplica modelagem estatística para determinar e quantificar a atividade de edição. CRISPECTOR mede com precisão a atividade fora do alvo em cada locus interrogado. Além disso, permite melhores taxas de falso-negativo em sites com atividade fora do alvo fraca, mas significativa. É importante ressaltar que um dos novos recursos do CRISPECTOR é sua capacidade de detectar eventos adversos de translocação que ocorrem em um experimento de edição.
“Na edição do genoma, especialmente para aplicações clínicas, é fundamental identificar baixo nível de atividade fora do alvo e eventos adversos de translocação. Mesmo um pequeno número de células com potencial carcinogênico, quando transplantado para um paciente no contexto de terapia genética, pode ter consequências prejudiciais em termos de patogênese do câncer. Como parte dos protocolos de tratamento, é, portanto, importante detectar esses eventos potenciais com antecedência “, disse o Dr. Ayal Hendel, da Universidade Bar-Ilan, da Mina e da Faculdade de Ciências da Vida Everard Goodman.
O Dr. Hendel conduziu o estudo, juntamente com o Prof. Zohar Yakhini, da Escola Arazi de Ciência da Computação do Centro Interdisciplinar (IDC) de Herzliya. “CRISPECTOR fornece um método eficaz para caracterizar e quantificar erros potenciais induzidos por CRISPR, melhorando significativamente a segurança do uso clínico futuro de edição de genoma.” A equipe de Hendel usou a tecnologia CRISPR-Cas9 para editar genes em células-tronco relevantes para doenças do sangue e do sistema imunológico. No processo de análise dos dados, eles tomaram conhecimento das deficiências das ferramentas existentes para quantificar a atividade fora do alvo e das lacunas que deveriam ser preenchidas para melhorar a aplicabilidade. Essa experiência levou à colaboração com o grupo líder de biologia computacional e bioinformática do Prof Yakhini.
O professor Zohar Yakhini, do IDC Herzliya e do Technion, diz: “Em experimentos que utilizam técnicas de sequenciamento profundo que têm níveis significativos de ruído de fundo, baixos níveis de atividade fora do alvo podem se perder sob o ruído. A necessidade de uma medição abordagem e análise de dados relacionados que são capazes de ver além do ruído, bem como de detectar eventos de translocação adversos que ocorrem em um experimento de edição, é evidente para cientistas e profissionais de edição de genoma. CRISPECTOR é uma ferramenta que pode filtrar o ruído de fundo para identificar e quantificar sinais fora do alvo verdadeiros. Além disso, usando modelagem estatística e análise cuidadosa dos dados, o CRISPECTOR também pode identificar um espectro mais amplo de aberrações genômicas. Ao caracterizar e quantificar possíveis erros induzidos por CRISPR, nossos métodos apoiarão o uso clínico mais seguro do genoma. edição de abordagens terapêuticas. “
Publicado em 25/05/2021 06h54
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