O limite de resolução convencional para amostras biológicas em microscopia de força atômica (AFM) foi quebrado sem a necessidade de melhorar a configuração física experimental. George Heath e sua equipe da Weill Cornell Medicine, em Nova York, fizeram isso aplicando conceitos de microscopia de localização a estudos de AFM molecular e mostraram que as imagens de AFM podem ganhar vida nova. A pesquisa, liderada por Simon Scheuring, é descrita em um artigo recente na Nature.
Vendo a estrutura molecular nas condições certas
Biomoléculas são estruturas complexas e dinâmicas que são difíceis de estudar porque devem ser observadas em condições que imitam o ambiente de uma célula biológica real. Além disso, é necessária resolução suficiente no espaço e no tempo para capturar totalmente o comportamento molecular. AFM já pode ser usado para moléculas de imagem em temperatura e pressão fisiologicamente relevantes, e também pode ser usado em um modo de alta velocidade (HS-AFM), onde resolução temporal suficiente pode ser alcançada para observar mudanças conformacionais de moléculas em tempo real.
O desafio restante foi obter resolução espacial suficiente na escala submolecular. Até recentemente, o AFM era limitado pelos raios das pontas de AFM, os menores dos quais são da ordem de alguns nanômetros e, portanto, não são nítidos o suficiente para resolver detalhes significativos em uma única biomolécula corrugada, macia e flexível em líquido. No entanto, inspirados por outras técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, Heath e seus colegas mostraram agora que a resolução até a faixa de angstrom (10-10 m) pode ser extraída de imagens AFM usando uma técnica de reconstrução de imagem pós-aquisição apelidada de localização AFM (LAFM).
O impacto da reconstrução pós-aquisição
A abordagem LAFM é baseada na ideia de que resolução superior às limitações físicas pode ser alcançada determinando a localização de sinais isolados com alta precisão espacial usando algoritmos de localização para processar várias imagens da amostra. Os resultados são então mesclados para criar um mapa compilado. Especificamente para AFM, esses sinais são máximos locais nos traços de altura – os locais onde a força entre a ponta e a amostra é maior. Eles são extraídos de várias imagens em locais específicos e, em seguida, mesclados em um mapa de probabilidade de pico.
Scheuring descreve a técnica: “Imagine que as características moleculares de alta resolução fossem bolas de gude em uma mesa e você estivesse tentando senti-las examinando uma bola de basquete sobre elas. Você provavelmente não pode resolvê-los. No entanto, se você imaginar que elas, como bolas de pingue-pongue individuais, saltam estocasticamente para cima, você será capaz de localizá-las individualmente. Mesclando posteriormente todas as coordenadas de localização, você será capaz de reconstruir o padrão dos mármores.”
Novo conhecimento sobre propriedades biomoleculares
Usando LAFM, a equipe resolveu características únicas nos loops salientes da superfície dos canais tetraméricos de aquaporina-Z (AqpZ). AqpZ é uma proteína que atua como um canal de água nas membranas celulares. Eles foram capazes de resolver detalhes comparáveis aos das estruturas cristalográficas de raios-X, detalhes que antes eram indetectáveis nas imagens AFM (veja a figura). A equipe também produziu vídeos mostrando mudanças conformacionais dependentes do pH na molécula CLC-ec1, que é encontrada em muitos organismos e células. Isso forneceu informações importantes sobre o mecanismo de transporte dessa molécula transportadora dimérica.
Um mapa LAFM pode ser reconstruído registrando muitas moléculas em alguns quadros ou observando uma única molécula por um período mais longo. Isso torna possível observar as mudanças conformacionais dependentes do tempo ou do ambiente, mas também adquirir informações de alta resolução de moléculas individuais. Esses recursos podem ajudar a aumentar significativamente a compreensão da estrutura e função biomolecular no futuro, e Scheuring espera que os mapas LAFM se tornem o novo padrão para imagens biomoleculares.
Publicado em 30/07/2021 12h58
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